里氏木霉来源β-葡聚糖酶基因的克隆与表征

论文摘要

p-葡聚糖酶是一类广泛存在于植物和微生物体内的水解酶,它能水解p-葡聚糖中的p-1,3和p-1,4-糖苷键,产生寡糖和还原单糖。p-葡聚糖酶在酿造业、饲料工业、制糖工业、造纸工业等领域有着广泛的应用。本研究主要对一株里氏木霉的β-葡聚糖酶基因（EG）进行克隆和表达,并比较研究了重组p-葡聚糖酶（EG）及其A35V突变株（MEG）的理化性质。根据NCBI GeneBank数据库中登录号为EU149644的基因序列信息,设计相关引物,用重叠延伸PCR法从里氏木霉基因组中克隆到一条长为657bp的EG编码基因。本文首先构建了pET-32a-eg重组质粒在大肠杆菌中进行表达,结果表明其在大肠杆菌中的重组蛋白大多数形成不表现活性的包涵体。大肠杆菌系统显然不适于重组EG的表达,本文采用毕赤酵母系统作为研究重组EG的表达系统。本文构建了pPIC9K-eg和pPIC9K-muteg （A35V）重组质粒,获得了重组EG和MEG （A35V）的表达菌株GS115；对构建的毕赤酵母工程菌株GS115-pPIC9K-eg的产酶条件进行优化,结果表明：菌株在初始pH为6.0的BMMY培养基中,初始诱导OD600为2.0,甲醇诱导浓度为2.0%,在30-C下发酵192h后酶活达到最高值47.738U/ml；经过盐析、脱盐、离子交换层析、疏水层析几个步骤的操作,对重组EG进行分离纯化,得到了回收率为62.46%、比活为1194.22U/mg的糖基化EG；用内切糖苷酶Endo Hf对重组EG进行处理,结果揭示重组EG包含糖基化和非糖基化两种形式,且糖基化EG占较大比例；糖基化EG的最适温度为60℃,最适pH为6.0；与糖基化EG相比,MEG最适温度、最适pH和pH稳定性没有改变,但酶的温度稳定性有一定程度的提高：MEG在60℃中处理时,酶失活的程度相对于糖基化EG低,甚至在70℃下处理10min,仍然能保持较高酶活,但在70℃中处理更长时间或者在更高温度下处理,酶活迅速损失。本文成功克隆了里氏木霉来源的β-葡聚糖酶基因,成功分离纯化获得糖基化的β-葡聚糖酶,对该酶及突变株的理化性质进行一定研究。本研究对促进EG的工业化生产具有重要的意义,对毕赤酵母发酵表达EG、重组EG分离纯化及EG的工业应用是很好理论的指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 B-葡聚糖
• 1.2 B-葡聚糖酶
• 1.2.1 β-葡聚糖酶的定义与分类
• 1.2.2 β-葡聚糖酶的来源
• 1.2.3 β-葡聚糖酶的应用
• 1.2.4 β-葡聚糖酶的分子生物学研究
• 1.2.4.1 β-葡聚糖酶基因的克隆
• 1.2.4.2 β-葡聚糖酶基因的表达与理化性质研究
• 1.2.4.3 β-葡聚糖酶的高级结构
• 1.3 外源基因表达系统
• 1.3.1 大肠杆菌表达系统
• 1.3.2 毕赤酵母表达系统
• 1.4 定向进化技术
• 1.5 蛋白质分离纯化技术
• 1.6 课题研究主要内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 药品
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR产物纯化回收
• 2.2.2 质粒抽提
• 2.2.3 大肠杆菌转化子的鉴定
• 2.2.3.1 PCR方法鉴定阳性克隆子
• 2.2.3.2 双酶切方法鉴定阳性克隆子
• 2.2.4 蛋白质含量的测定
• 2.2.5 EG编码基因的获取
• 2.2.5.1 里氏木霉基因组DNA提取
• 2.2.5.2 EG全基因序列的获取
• 2.2.5.3 TA克隆获得pMD-18T-eg0质粒
• 2.2.5.4 重叠延伸PCR法获取EG编码基因
• 2.2.6 EG基因定点突变获取mutEG基因
• 2.2.7 大肠杆菌表达EG编码基因
• 2.2.7.1 重组质粒pET-32a-eg的构建
• 2.2.7.2 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.7.3 pET-32a-eg转化E.coli BL21（DE3）
• 2.2.7.4 工程菌BL21（DE3）-pET-32a-eg诱导表达β-葡聚糖酶
• 2.2.8 毕赤酵母表达EG编码基因和mutEG基因
• 2.2.8.1 毕赤酵母系统表达载体pPIC9K
• 2.2.8.2 重组质粒pPIC9K-eg的构建
• 2.2.8.3 重组质粒pPIC9K-muteg的构建
• 2.2.8.4 毕赤酵母感受态的制备
• 2.2.8.5 pPIC9K-eg和pPIC9K-muteg转化Pichia pastoris GS115
• 2.2.8.6 阳性转化子GS115-pPIC9K-eg和GS115-pPIC9K-muteg的筛选
• 2.2.9 工程菌产酶条件的优化及其生长曲线与产酶曲线
• 2.2.9.1 甲醇添加量优化
• 2.2.9.2 培养基pH优化
• 2.2.9.3 诱导OD优化
• 2.2.9.4 工程菌GS115-pPIC9K-eg生长曲线与产酶曲线
• 2.2.10 β-葡聚糖苷酶的分离纯化
• 2.2.10.1 盐析
• 2.2.10.2 脱盐
• 2.2.10.3 离子柱层析
• 2.2.10.4 疏水柱层析
• 2.2.11 糖基化EG纯酶和MEG粗酶液理化性质研究
• 2.2.11.1 重组β-葡聚糖酶的糖基化
• 2.2.11.2 β-葡聚糖酶酶活定义及测定方法
• 2.2.11.3 糖基化EG和MEG的最适温度及温度稳定性研究
• 2.2.11.4 糖基化EG和MGE的最适pH和pH稳定性研究
• 2.2.11.5 金属离子和还原剂对糖基化EG酶活的影响
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 EG编码基因的获取
• 3.1.1 里氏木霉基因组的提取
• 3.1.2 EG全基因的获取
• 3.1.3 EG编码基因的获取
• 3.2 MUTEG的获取
• 3.3 大肠杆菌表达EG编码基因
• 3.3.1 pET-32a-eg重组质粒的构建
• 3.3.3 工程菌BL21（DE3）-pET-32a-eg的诱导表达
• 3.4 毕赤酵母表达EG编码基因和MUTEG基因
• 3.4.1 毕赤酵母表达EG编码基因
• 3.4.1.1 pPIC9K-eg重组质粒的构建
• 3.4.1.2 工程菌GS115-pPIC9K-eg的筛选
• 3.4.2 毕赤酵母表达mutEG基因
• 3.4.2.1 pPIC9K-muteg重组质粒的构建
• 3.4.2.2 工程菌GS115-pPIC9K-muteg的筛选
• 3.5 工程菌产酶条件优化
• 3.5.1 产酶条件的优化
• 3.5.1.1 培养基甲醇添加量的优化
• 3.5.1.2 培养基pH的优化
• 3.5.1.3 工程菌初始诱导OD的优化
• 3.5.2 工程菌生长曲线与产酶曲线
• 3.6 B-葡聚糖酶分离纯化
• 3.6.1 盐析预试验
• 3.6.2 脱盐
• 3.6.3 DEAE柱层析
• 3.6.4 Butyl柱层析
• 3.6.5 分离纯化表
• 3.6.6 重组β-葡聚糖酶糖基化确定
• 3.7 糖基化EG及MEG理化性质研究
• 3.7.1 糖基化EG和MEG的最适温度及温度稳定性
• 3.7.2 糖基化EG和MEG的最适pH和pH稳定性
• 3.7.3 金属离子及还原剂对糖基化EG的影响
• 3.8 讨论
• 第四章 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历