生物大分子与小分子相互作用研究

论文摘要

蛋白质是细胞内重要的生物大分子、功能分子,它具有运载和储存功能,其生物功能与其特定结构密切相关,在所有的生命过程中起着关键的作用。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被运送到身体的各部位发挥药效。从分子水平上研究血清蛋白与药物小分子的相互作用,有助于了解药物的转运和代谢过程,可以为高活性药物小分子的设计与开发提供有价值的信息。在分子水平上阐明这些生物大分子与小分子、离子,特别是靶向药物分子的相互作用,是当前生命科学、临床医学、药物化学及化学等许多领域的热门研究课题。本论文是浙江省自然科学基金资助项目（No.202056）“抗癌药物与血清白蛋白、DNA的相互作用研究”和国家自然科学基金资助项目（No.20273061）“氨基酸在模拟体液中的热力学性质研究”的部分工作,其主要内容由以下几部分工作组成:1.综合应用多种方法研究了血清蛋白与喹诺酮类药物的结合反应及作用机制,研究方法文中得到了进一步的拓展。在研究方法上分别应用了紫外光谱法、荧光光谱法、同步荧光光谱法、三维荧光光谱法、三维偏振荧光光谱法、共振Rayleigh散射法及毛细管电泳法,从不同角度对所涉及体系进行研究,充分发挥了每种方法的优势,各方法相互补充、相互印证,较全面反应了喹诺酮药物与所研究靶标生物大分子的结合反应。2.利用紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱和同步荧光光谱等技术,研究了pH=7.36的Tris-HCl缓冲溶液中盐酸洛美沙星（LMFX）与人血清白蛋白（HSA）的相互作用,研究了不同温度下LMFX与HSA的猝灭情况,分别用Stern-Volmer方程和Scatchard法、Lineweaver-Burk双倒数方程、双对数方程等模型进行处理,并利用热力学公式推导了两者之间的相互作用力。研究表明,在实验浓度范围内和300、310K温度下,LMFX与HSA可相互作用形成复合物;荧光猝灭作用符合静态猝灭作用特征;并得到了相互作用的相关参数,结合常数KA为104～105L·mol-1,说明HSA对该药物有中等强度的亲和性;结合位点数大于1,因而LMFX可被人血清白蛋白贮存和运输。其中该结合反应用双对数方程处理,线性吻合更好,得到ΔG＜0,ΔH＜0,ΔS＜0,故盐酸洛美沙星与HSA之间的作用主要是氢键或者范德华力作用,且反应能自发进行。此外,LMFX会导致人血清蛋白色氨酸残基附近微环境极性增加,疏水性略有降低,使得人血清白蛋白的肽链伸展。根据F（o|¨）ster偶极-偶极非辐射能量转移原理,计算得到HSA中色氨酸残基与已结合的盐酸洛美沙星分子间的距离为2.85nm,小于7nm,符合能量转移理论,说明在盐酸洛美沙星与HSA之间发生了能量转移。3.用荧光光谱法、共振Raylei曲散射研究了金属离子对HAS-LMFX间结合反应的影响,Fe3+会改变LMFX药物与HSA结合体的构象,促使共振Rayleigh散射强度明显增大。结果表明,Fe3+能和LMFX与HSA结合,引起荧光猝灭,共振瑞利散射强度大大增强,其荧光猝灭程度（△F）以及RRS增强的程度(△IRRS)均与Fe3+的浓度成正比,反应具有高灵敏度。共振Rayleigh散射技术是二十世纪九十年代发展起来的一种分析技术,由于其在研究生色团与生物大分子的聚集作用以及具有相反电荷的离子之间的离子缔合作用时显示出高的灵敏度和选择性,特别是对于生物大分子的一些非键合作用特别敏感,而成为生物大分子的测定和表征的一种非常有用的技术。4.利用三维荧光、三维偏振荧光光谱技术研究了人血清白蛋白（HSA）与盐酸洛美沙星（LMFX）、甲磺酸培氟沙星（PFLX）、司帕沙星（SPFX）和加替沙星（GTFX）四种喹诺酮药物非共价结合作用前后自身荧光强度、偏振度P以及各向异性值r的变化,及对其构象的影响。由相应的荧光指纹图谱得到的荧光峰位置、荧光强度、Stokes位移等指纹信息,说明HSA的色氨酸残基处于蛋白质内部的疏水区域,所处周围微区环境性质由于药物分子的插入引起较大的变化,极性明显增强,从而导致HSA构象的改变,引起其三维荧光光谱发生较大的变化,荧光峰红移,Stokes位移增大,荧光强度降低;同时,由相互作用后的荧光偏振度P及各向异性r的增大,定量地证明HSA与喹诺酮药物之间确实发生了相互结合反应。5.利用荧光猝灭法和动态光散射法测定尿素-水混合溶剂中牛血清白蛋白（BSA）与荧光素的结合距离和BSA的流体动力学半径,并通过分析BSA和荧光素在BSA-尿素-水和荧光素-尿素-水三元体系以及BSA-荧光素-尿素-水四元体系中荧光光谱的变化,探讨尿素与蛋白质分子在水溶液中相互作用的机理及其对蛋白质构象的影响。结果显示,BSA的3个结构域在尿素-水混合溶剂中具有不同的稳定性,其中结构域Ⅲ在尿素-水混合溶剂中是不稳定的,而结构域Ⅰ和结构域Ⅱ分别在尿素浓度大于3.0和4.0 mol·L-1的混合溶剂中发生去折叠。试验发现,BSA结构域Ⅱ在低于去折叠浓度的尿素-水混合溶剂中形成更为紧密的构象,这一现象可以归因于尿素与BSA结合引起的“蛋白质粘稠效应”。6.利用Anton Paar DMA55精密数字密度计测定了288.15,298.15和308.15 K甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸在蔗糖-水混合溶剂中的密度,计算了它们的表观摩尔体积VΦ和极限偏摩尔体积VΦO,得到了其由纯水溶剂转移至混合溶剂中的迁移偏摩尔体积△trsVΦO和理论水化数Nh。根据共球交盖模型,讨论了迁移偏摩尔体积和水化数的变化规律。结果表明,这些模型化合物带电中心与蔗糖之间的结构相互作用对其迁移体积有正贡献,且占主导地位。模型化合物的迁移偏摩尔体积为正值,且随着蔗糖浓度的增大而增大;理论水化数随温度升高、蔗糖浓度的增大而减小;温度升高,极限偏摩尔体积增大,迁移偏摩尔体积变化很小。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 生物大分子与小分子相互作用研究概述
• 1.1 研究背景
• 1.2 生物大分子和小分子
• 1.2.1 血清白蛋白
• 1.2.2 DNA
• 1.2.3 蛋白质模型分子
• 1.2.4 小分子
• 1.3 血清白蛋白、DNA与小分子相互作用的研究方法及研究进展
• 1.3.1 紫外可见吸收光谱法
• 1.3.2 荧光光谱法
• 1.3.3 圆二色光谱（CD）和线二色谱（LD）
• 1.3.4 傅里叶变换红外（FT-IR）光谱
• 1.3.5 毛细管电泳（CE）
• 1.3.6 电化学方法
• 1.3.7 核磁共振法
• 1.3.8 热化学方法
• 1.3.9 平衡透析法
• 1.3.10 计算机模拟
• 1.3.11 其他方法
• 1.4 生物大分子与小分子相互作用研究内容
• 1.4.1 相互作用的模式
• 1.4.2 结合常数和结合点位数的确定
• 1.4.3 结合部位的确定
• 1.4.4 结合距离的确定
• 1.4.5 作用力类型的确定
• 1.4.6 影响结合反应的因素
• 1.4.7 小分子对大分子构象的影响
• 1.5 本论文立题依据和研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 荧光光谱法研究人血清白蛋白与盐酸洛美沙星相互作用
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 盐酸洛美沙星对人血清白蛋白荧光光谱的影响
• 2.3.2 荧光猝灭机理
• 2.3.3 结合常数和结合位点数
• 2.3.4 结合反应的热力学参数及作用力类型
• 2.3.5 结合距离
• 2.3.6 盐酸洛美沙星对HSA构象的影响
• 3+对LMFX-HSA体系的影响'>2.3.7 金属离子Fe³⁺对LMFX-HSA体系的影响
• 3+对药物—血清白蛋白共振Rayleigh散射强度影响'>2.3.8 金属离子Fe³⁺对药物—血清白蛋白共振Rayleigh散射强度影响
• 2.3.8.1 共振瑞利散射原理
• 2.3.8.2 共振瑞利散射光谱
• 3+浓度与散射强度的关系'>2.3.8.3 Fe³⁺浓度与散射强度的关系
• 2.4 本章小结
• 第三章 毛细管电泳法研究牛血清白蛋白与盐酸洛美沙星相互作用
• 3.1 引言
• 3.2 CE分析药物与BSA相互作用的基本原理
• 3.3 实验部分
• 3.3.1 实验仪器与试剂
• 3.3.2 溶液的制备
• 3.3.3 前沿分析方法绘制工作曲线
• 3.3.4 样品前沿分析
• 3.3.5 空峰方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 关于实验条件的讨论
• 3.4.2 典型图谱定性分析
• 3.4.3 结合常数和结合位点数
• 3.5 本章小结
• 第四章 三维荧光、三维偏振荧光法研究人血清白蛋白与喹诺酮药物相互作用
• 4.1 引言
• 4.2 原理
• 4.2 实验部分
• 4.3.1 主要仪器和药品
• 4.3.2 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 蛋白质色氨酸残基的三维荧光光谱
• 4.4.2 温度对三维荧光光谱的影响
• 4.4.3 蛋白质色氨酸残基的三维偏振荧光光谱
• 4.4.4 金属离子对三维荧光光谱的影响
• 4.5 本章小结
• 第五章 荧光猝灭法和动态光散射法研究尿素-水混合溶剂中牛血清白蛋白构象变化
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 仪器和试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 激光粒度仪简介
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 不同温度下氨基酸及其低聚物在蔗糖-水溶剂中的体积性质
• 6.1 前言
• 6.2 体积性质的基本理论
• 6.2.1 表观摩尔体积
• 6.2.1.1 偏摩尔体积和表观摩尔体积
• 6.2.1.2 无限稀释表观摩尔体积
• 6.2.1.3 迁移偏摩尔体积
• 6.2.2 理论水化数
• 6.3 实验
• 6.3.1 试剂
• 6.3.2 密度测定
• 6.3.2.1 仪器的结构和测量原理
• 6.3.2.2 测量方法
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 蛋白质模型分子在蔗糖-水溶剂中的极限偏摩尔体积及迁移偏摩尔体积
• 6.4.2 蛋白质模型分子在蔗糖-水溶剂中溶剂化层的电荷分布情况
• 6.4.3 蛋白质模型分子的结构对迁移偏摩尔体积影响
• 6.4.4 温度对模型分子的迁移偏摩尔体积的影响
• 6.4.5 论水化数
• 6.5 本章小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 攻博期间撰写的学术论文