重组导向毒素DLM表达、抗肿瘤活性及作用机制的初步研究

论文摘要

导向毒素具有特异性结合、杀伤肿瘤细胞的特性。但是,目前研究的许多导向毒素在实际应用过程中却表现出抗肿瘤疗效差,非特异性毒性强的问题。为开发高特异性低毒的导向毒素,本研究以蛇毒去整合素作为导向毒素的载体,以对细胞具有杀伤作用的蜂毒肽作为导向毒素的弹头,通过维持蛋白质结构功能的连接肽和释放毒素分子的uPA切割序列作为接头,设计出重组导向毒素DLM（蛇毒去整合素-接头-蜂毒肽,Disintegrin-linker-melittin, DLM）。首先采用大肠杆菌原核表达系统对其进行表达,得到了少量的DLM蛋白。为了进一步提高DLM的产量,我们构建了毕赤酵母真核表达载体,并筛选出能够稳定、高效分泌表达DLM蛋白的毕赤酵母工程菌。通过SDS-PAGE、Western Blot、质谱测定相对分子量等手段,证明了DLM通过毕赤酵母表达系统成功分泌表达。利100 L用发酵罐进行DLM中试规模发酵,并摸索其纯化工艺,最终DLM的产量达到198.4 mg/L。通过体外酶解实验,证实了重组蛋白DLM的uPA接头的可切割性。进行了DLM溶血实验及对人胚肾细胞抑制作用实验。结果显示DLM几乎无溶血活性,对人胚肾细胞无明显的抑制作用。利用光镜、荧光显微镜、DNA电泳、流式细胞仪技术,观察了DLM对乳腺癌细胞MCF-7的形态、超微结构、生长、基因组DNA等指标的影响,初步探讨出其作用机制。本研究的创新之处在于：①首次以蛇毒去整合素作为导向载体,针对肿瘤细胞表面特异性受体αvβ3设计高特异性的导向毒素；②首次以uPA切割序列作为导向毒素的接头,通过肿瘤细胞表面uPA对接头的切割作用,释放毒素分子；③通过uPA对接头的切割作用,将弹头分子蜂毒肽释放于肿瘤细胞表面,通过裂解细胞膜发挥其对细胞的杀伤作用。

论文目录

• 提要
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 第1章 绪论
• 1.1 肿瘤靶向治疗
• 1.1.1 肿瘤靶向治疗药物的基本原则
• 1.1.2 靶向给药的屏障
• 1.1.3 靶向药物的摄入和药物活性
• 1.1.4 靶向药物的设计
• 1.1.5 靶向药物载体系统
• 1.1.6 靶向药物的连接
• 1.2 蛇毒去整合素及整合素AVB3
• 1.2.1 蛇毒去整合素
• 1.2.2 整合素
• 1.3 UPA系统
• 1.3.1 uPA
• 1.3.2 uPAR
• 1.3.3 纤溶酶原激活物抑制剂
• 1.3.4 tPA
• 1.3.5 uPA/uPAR和整合素
• 1.4 MELITTIN
• 1.4.1 具有凋亡作用的多肽
• 1.4.2 具有坏死作用的多肽
• 1.4.3 蜂毒肽研究进展
• 1.5 本论文的立论依据
• 第2章 DLM原核表达体系的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第3章 DLM毕赤酵母分泌表达体系的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第4章 DLM的中试规模发酵、纯化工艺及活性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第5章 DLM对乳腺癌杀伤作用研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 实验结果
• 5.3 讨论
• 第6章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢