鹅细小病毒VP2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）主要引起4-20 日龄雏鹅和雏番鸭的高致死性疾病,称为小鹅瘟或Derzsy’s 病。本病以消化道,尤其是小肠部位典型纤维素性栓塞病变为特征,发病率和死亡率可达70%-100%,是危害养鹅业的主要疾病之一。目前尚无治疗该病的特效药物,主要通过接种传统疫苗进行预防;该病的诊断主要依据临床症状结合血清学方法,这些方法大多费时费力。由于本病传播迅速、致死率高,开发研制新型的基因工程疫苗以及建立一种快速、简便、特异的诊断方法非常必要。VP2 是鹅细小病毒的主要免疫功能区,可刺激机体产生中和抗体,是GPV 的重要保护性抗原,与主要结构蛋白VP3 存在相同的抗原决定簇成分,是制备基因工程疫苗的重要候选基因。我国目前有关GPV 分子生物学和基因工程方面的研究刚刚起步。本实验室在前期的研究中成功的用鹅胚分离到鹅细小病毒中国分离株HG5/82,将非结构基因与结构基因分别进行克隆及序列测定,并与国内外分离株相应基因进行分析比较,对其分子生物学特征进行了回顾性研究。本研究对GPV 中国分离株HG5/82 鹅胚尿囊液通过电镜观察及琼脂扩散试验鉴定后,参考孔宪刚等发表的GPV 中国分离株HG5/82 基因序列,设计引物,对该毒株的VP2 基因进行扩增,利用DNA重组技术,将目的片断,即VP2 氨基端共969bp 基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHTb 中,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,用IPTG 诱导后成功表达出与预期大小相符的约36kDa 的融合蛋白,表达形式为包涵体。光密度扫描对表达产物进行定量分析,表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。表达产物经镍离子亲和树脂纯化后,得到了纯度较高的带有6×His 标签的目的蛋白。用所获得的纯化产物经三次肌肉注射新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体,采用Western blot 方法对表达产物进行反应原性分析,结果表明所得融合蛋白具有较好的反应原性。本研究为进一步筛选具有抗原表位的GPV 基因片段,以获得高效、具有活性的重组蛋白,以及研究GPV 衣壳蛋白的分子生物学特征奠定了基础,为抗鹅细小病毒感染基因工程疫苗、分子生物学诊断试剂的开发研制提供了理论依据和实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 1 小鹅瘟的研究概况
• 2 鹅细小病毒的特征
• 2.1 分类地位
• 2.2 形态结构和理化特性
• 2.3 宿主范围和培养特性
• 2.4 GPV 与 MDPV 的关系
• 3 鹅细小病毒的基因组结构及复制
• 3.1 基因组结构
• 3.2 基因转录和复制
• 4 鹅细小病毒的非结构蛋白和结构蛋白
• 4.1 非结构蛋白
• 4.2 结构蛋白
• 5 鹅细小病毒病
• 5.1 流行病学
• 5.2 症状及病变
• 5.3 诊断
• 5.4 防制
• 6 基因工程疫苗研究进展
• 7 研究的目的和意义
• 实验部分
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 鹅细小病毒HG5/82 株结构蛋白VP2 基因的克隆和鉴定
• 2.2 VP2 部分基因（9696p）原核表达载体的构建
• 2.3 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及重组蛋白表达量的确定
• 2.4 表达产物的 SDS-PAGE 分析及 Western blot 检测
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介