控制性促排卵黄体期添加雌激素对子宫内膜容受性影响的实验研究

论文摘要

1.研究背景不孕症（Infertility）发病率约占育龄妇女的10～15%,是影响家庭乃至社会和谐与稳定的重要因素之一。受孕成功的四大因素是:高质量的卵子和精子、通畅的输卵管和良好的子宫内膜,四者缺一不可。其中子宫内膜是胚胎种植的“土壤”,良好的子宫内膜环境是受孕成功的关键。所以,子宫内膜容受性（Endometrialreceptivity）是目前生殖领域研究的热点。正常子宫内膜仅在一特定时期允许着床,这一时期子宫内膜容受性最高,称为着床窗口期（Window of implantation）,一般为排卵后6～10d,即正常月经周期的19～24d。子宫内膜容受性的评价标准包括子宫内膜厚度、形态、母体内分泌状况和子宫内膜的生殖调控因子,包括细胞形态学、分子生物学和基因水平的研究,如:胞饮突（pinopode,pp）、白血病抑制因子（Leukaemia inhibitory factor,LIF）、整合素家族（Integrins）、白细胞介素1（IL-1）、表皮生长因子（EGF）、集落刺激因子（CSF-1）、雌孕激素受体等。控制性促排卵（Contral Ovarian Stimulation,COS）体外受精-胚胎移植（InVitro Fertilization and Embryo Transfer,IVF-ET）技术已较广泛地用于治疗难治性不孕症,其临床妊娠成功率受诸多因素的影响。如何提高其胚胎种植率和临床妊娠率是一个亟待解决的难题。子宫内膜容受性与胚胎质量是影响IVF-ET成功率的两大主要因素。而胚胎着床前子宫内膜的容受状态受雌、孕激素及生殖调控因子的协同调节。在IVF-ET控制性促排卵中大多数应用促性腺激素释放激素协同剂（Gonadotropicreleasingllormoneagonist,GnRHa）进行降调节,通过抑制内源性的促黄体生成素（Lutenizing Hormone,LH）峰的出现,使多个卵泡募集,获得多个高质量的卵子,与精子结合形成多个胚胎,选择优秀的胚胎进行移植,从而提高妊娠成功率,改善妊娠结局。但是,这种抑制作用可使排卵后黄体期的LH分泌也受到抑制,导致黄体功能不足,胚胎种植率和妊娠率的降低。对接受控制性促排卵WF-ET患者进行黄体支持已得到大家的公认。传统的黄体支持方法是黄体期应用黄体酮（Progesterone,p）,如何改进黄体期支持方案增加子宫内膜容受性以提高胚胎种植率和WF-ET妊娠成功率是近年来生殖领域研究的热点。近来有学者试着在传统方案的基础上添加小剂量雌激素,但只是在初步探索阶段,尚无确切的定论。到目前为止,有关黄体期支持添加雌激素与子宫内膜容受性关系的研究,报道甚少,尚未见运用细胞形态学、免疫组化、分子生物学手段及临床资料统计分析联合证实黄体期添加雌激素对子宫内膜容受性影响的研究。2.研究目的为探讨COS黄体期支持添加小剂量雌激素对子宫内膜容受性的影响,本课题首先通过建立动物模型,采用细胞形态学、免疫组化和分子生物学技术,观察不同COS黄体期支持方案小鼠子宫内膜胞饮突、LIF和LIFmRNA的表达,从而总结添加雌激素对小鼠子宫内膜容受性的影响。在此基础上,对临床进行控制性促排卵IVF-ET的患者进行回顾性分析,观察其胚胎移植（Embryo transfer,ET）日血清雌二醇（Estradiol,E2）水平较注射绒毛膜促性腺激素（hCG）日下降幅度对人胚胎种植率和临床妊娠率的影响,进而对临床接受控制性促排卵IVF-ET患者采用不同方案进行黄体期支持,对各组患者IVF-ET实验室和临床资料进行研究分析,探讨ET日E2下降幅度对人胚胎种植率和临床妊娠率的影响及黄体期支持添加雌激素的必要性。通过系列研究,深入探讨雌激素与子宫内膜容受性关系的内在分子机制,从而揭示控制性促排卵黄体期支持添加雌激素对子宫内膜容受性的影响,为改进临床治疗方案、提高IVF-ET技术妊娠成功率提供一定的理论依据。3.材料与方法3.1动物实验材料与方法3.1.1分组方法:将正常雌性小鼠随机分为四组:A组、B组和C组均采用控制性促排卵,用hCG后分别与正常雄性小鼠2:1合笼,次日清晨检查阴栓,有阴栓者为受孕第1d;D组:自然周期组,与正常雄性小鼠2:1合笼,次日清晨检查阴栓,有阴栓者为受孕第1d。3.1.2用药方法:控制性促排卵的雌性小鼠从受孕第1d开始接受不同的黄体期支持方法:A组:不采用黄体期药物支持;B组:单用黄体酮进行黄体期支持;C组:在应用黄体酮的基础上添加雌激素;D组:同时应用同等量的生理盐水。3.1.3取材:A、B、C、D组小鼠分别于孕第3、4、5d剖腹取子宫。3.1.4扫描电镜（scanning electronic microscopy,SEM）观察各组受孕小鼠围植入期胞饮突的表达。3.1.5采用免疫组化（Immunohistochemistry,SP）法检测LIF蛋白在各组受孕小鼠围植入期子宫内膜的表达情况。3.1.6采用逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptional-polymerise chain reaction,RT-PCR）法检测LIFmRNA在各组受孕小鼠围植入期子宫内膜的表达情况。3.2临床材料与方法3.2.1回顾性分析97个接受长方案控制性超排卵（COS）及IVF-ET治疗周期。应用电化学发光技术分别测定hCG日和ET日血清雌二醇（E2）水平。根据ET日血清雌二醇（E2）下降幅度分为6组:组1:12个治疗周期,E2下降幅度＜20%;组2:13个,E2下降幅度20%～29%;组3:11个周期,E2下降幅度30%～39%;组4:16个周期,E2下降幅度40%～49%;组5:24个周期,E2下降幅度50%～59%;组6:21个周期,E2下降幅度≥60%。观察ET日血清雌二醇（E2）下降幅度对胚胎种植率和临床妊娠率的影响。3.2.2为探讨雌激素添加是否可以改善IVF-ET的结局,回顾性分析216个长方案控制性超排卵IVF-ET周期的治疗结果,根据其黄体期支持用药情况分为两组:A1组:97个周期,单用黄体酮进行黄体期支持;B1组:119个周期,对移植日血清雌二醇（E2）水平下降幅度≥30%的89个周期采用黄体酮加小剂量雌激素进行黄体期支持。3.2.3为了探讨雌激素添加的剂量及方案,回顾性分析104个长方案控制性促排卵IVF-ET周期的治疗结果,根据其移植日血清E2下降幅度黄体期支持添加雌激素的剂量分为四组:A2组:12个周期,单用黄体酮进行黄体期支持;B2组:18个周期,移植日血清E2水平较hCG日下降幅度在30%～390,其黄体期支持采用黄体酮加3mg雌激素;C组:16个周期,移植日血清E2水平下降幅度40%～49%;D组:58个周期,移植日血清E2水平下降幅度≥50%;对于C组、D组患者采用黄体酮加4mg雌激素进行黄体期支持。3.2.4对比雌激素添加与传统黄体期支持方案胚胎种植率和临床妊娠率的差异。3.2.5对比添加不同剂量的雌激素其胚胎种植率和临床妊娠率的差异。3.3数据处理与统计学分析采用SPSS11.0统计软件进行分析,数值变量采用t检验或方差分析,分类变量采用卡方检验或精确概率法检验,P＜0.05为差异有统计学意义。4.结果4.1动物实验结果4.1.1子宫内膜胞饮突表达结果:B、C、D组小鼠子宫内膜孕第3d为发育中的胞饮突,孕第4d子宫内膜表面胞饮突完全发育,边界清楚,大小一致,呈蘑菇样外观,5d子宫内膜可见退化的胞饮突;C和D组较好,B组稍次之。A组于孕3d即可见少量完全发育的胞饮突,但凸起较小,大小不均,第4d胞饮突开始退化。4.1.2子宫内膜LIF蛋白定性表达结果:在C、D组受孕小鼠,孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表达水平呈弱阳性着色,孕4d时LIF蛋白表达水平显著上升达峰值,呈强阳性着色（++）,孕5d时呈阳性着色（+）。B组孕3d腺上皮和腔上皮呈弱阳性着色,孕4d时,LIF蛋白表达水平呈阳性着色（+）,孕5d时呈弱阳性着色。A组孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表达水平呈阳性着色（+）,孕4d和5d时呈弱阳性着色。4.1.3子宫内膜LIF蛋白半定量表达结果:图像分析和统计学处理结果显示小鼠C、D组受孕第3、4、5d子宫内膜LIF蛋白的表达水平均明显高于A组（P＜0.05）;B组第3、4、5d子宫内膜LIF蛋白的表达水平高于A组（P＜0.05）,但明显低于C、D组,差异有统计学意义（P＜0.05）。D组与C组相比无统计学差异。4.1.4子宫内膜LIF mRNA表达组内比较结果:B、C、D组孕鼠子宫内膜LIFmRNA表达均为阳性,A组孕鼠LIF mRNA的表达极弱。半定量分析表明:组内比:B、C、D组受孕小鼠均于孕4d时LIF蛋白表达水平达峰值,而A组于孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表达水平最高,孕4d和5d时较低。4.1.5 LIF mRNA表达各组间比较结果:各组小鼠子宫内膜LIF mRNA表达半定量分析组间比结果:小鼠C、D组明显高于A组;B组高于A组（P＜0.05）,但明显低于C、D组,差异有统计学意义（P＜0.05）。C组与D组相比无统计学差异。4.1.6 LIF mRNA表达高峰期比较结果:B、C、D组小鼠孕4d与A组孕3天相比,其子宫内膜胞饮突表达、腺上皮和腔上皮LIF蛋白表达、LIF mRNA表达结果:C和D组最好,B组稍次之,A组最差。LIF蛋白图像分析、LIF mRNA半定量分析和统计学处理结果显示:小鼠C、D组明显高于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）;B组高于A组（P＜0.05）,但明显低于C、D组,差异有统计学意义P＜0.05);C组与D组相比无统计学差异。4.2临床实验结果4.2.1 ET日血清E2水平均呈不同程度的下降。4.2.2当ET日血清E2水平下降幅度≥30%时胚胎种植率和妊娠率明显降低,差异出现有统计学意义（P＜0.05）。4.2.3其中下降幅度≥30%者占总周期数的74.23%。4.2.4年龄大的患者其下降幅度偏大,但无统计学差异。4.2.5各组参数比较结果:A1组与B1组的取卵数目、受精率、卵裂率、人绒毛膜促性腺激素（hCG）日E2水平、优质胚胎数、内膜厚度和移植胚胎数目相比差异无统计学意义（P＞0.05）;A2组、B2组、C组、D组的取卵数目、受精率、卵裂率、人绒毛膜促性腺激素（HCG）日E2水平、优质胚胎数、内膜厚度和移植胚胎数目相比差异无统计学意义（P＞0.05）4.2.6 A1组与B1组结果比较:A1组当胚胎移植日血清E2下降幅度≥30%时,胚胎种植率和临床妊娠率下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;B1组当E2下降幅度≥40%时,胚胎种植率和临床妊娠率差异有统计学意义（P＜0.05）;说明给予3mg/d戊酸雌二醇补充改善了E2下降幅度在30～40%的患者,而下降幅度≥40%的患者需较大量的雌激素补充。两组整体相比,B1组胚胎种植率明显高于A1组（P＜0.05）,妊娠率亦高于A1组,但无统计学差异（P=0.15）。4.2.8添加不同剂量雌激素结果比较:根据E2下降幅度添加不同剂量的雌激素,C组当E2下降幅度≥40%时,IVF的妊娠率和种植率的差异无统计学意义（P＞0.05）:D组当E2下降幅度≥50%时,IVF的妊娠率和种植率的差异有统计学意义（P＜0.05）。添加戊酸雌二醇3mg/d改善了E2下降幅度在30～39%的患者胚胎种植率和临床妊娠率;添加戊酸雌二醇4mg/d改善了E2下降幅度在40～49%的患者的胚胎种植率和临床妊娠率;而添加戊酸雌二醇4mg/d对于E2下降幅度在≥50%的患者其胚胎种植率和临床妊娠率仍无明显的改善。5.结论5.1控制性促排卵使胞饮突、LIF蛋白和LIFmRNA在小鼠子宫内膜的表达减弱,且使子宫内膜着床窗口期提前,从而对子宫内膜容受性有负面影响。5.2控制性促排卵黄体期给与黄体酮能明显改善小鼠子宫内膜容受性。5.3控制性促排黄体期支持添加雌激素和单用黄体酮相比,前者更能改善小鼠子宫内膜胞饮突、LIF蛋白和LIFmRNA在小鼠子宫内膜的表达,且纠正了COS使内膜窗口期前移的负面影响,从而增加子宫内膜容受性。5.4长方案COS及IVF-ET中,ET日E2水平较HCG日相比有不同程度的下降,当其下降幅度≥30%时引起胚胎种植率和妊娠率的降低。5.5长方案COS及IVF-ET中,ET日E2水平下降幅度≥30%者占总周期数的74.23%。5.6年龄大的患者其ET日E2下降幅度偏大。5.7长方案COS及IVF-EF中,当移植日血清E2水平下降幅度≥30%时黄体期支持给予雌激素补充可以改善胚胎种植率和临床妊娠率。5.8雌激素补充的剂量要根据E2下降幅度而定,E2下降幅度越大补充雌激素的剂量也应增大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• Ⅰ 实验部分:控制性促排卵黄体期添加小剂量雌激素对小鼠子宫内膜胞饮突和白血病抑制因子的影响
• Ⅰ.1 前言
• Ⅰ.2 材料与方法
• Ⅰ.3 结果
• Ⅰ.4 讨论
• Ⅰ.5 参考文献
• Ⅰ.6 附图
• Ⅱ 临床部分1:胚胎移植日血清雌激素下降幅度对IVF-ET治疗结局的影响
• Ⅱ.1 前言
• Ⅱ.2 材料与方法
• Ⅱ.3 结果
• Ⅱ.4 讨论
• Ⅱ.5 参考文献
• Ⅲ 临床部分2:黄体期雌激素补充方案对IVF-ET治疗结局的影响
• Ⅲ.1 前言
• Ⅲ.2 材料与方法
• Ⅲ.3 结果
• Ⅲ.4 讨论
• Ⅲ.5 参考文献
• Ⅲ.6 附图
• Ⅵ 全文小结
• Ⅴ 本研究的创新性
• Ⅵ 综述:子宫内膜容受性及其影响因素研究进展
• Ⅵ 参考文献
• Ⅶ 博士研究生期间发表的论文及获奖情况
• Ⅷ 英文缩写词索引
• Ⅸ 致谢