玉米赤霉烯酮对体外培养猪卵巢颗粒细胞的毒性作用及凋亡机理研究

论文摘要

玉米赤霉烯酮（ZEA）是主要由镰刀菌产生的霉菌毒素,ZEA具有类雌激素作用,可与子宫内雌激素受体不可逆结合,表现出生殖发育毒性,此外,ZEA还具有免疫毒性、致癌性、遗传毒性、细胞毒性和肝毒性,其中猪对其毒性最为敏感。研究目的：以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,通过研究ZEA对其毒性作用,来揭示ZEA对猪生殖系统的毒性作用,为找到其解毒方法提供一定的理论依据。研究方法：采用机械分离法从1-5mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,Giemsa和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测FSHR表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线；于细胞对数生长期加入60,90和120μM的ZEA作用24h后,MTT法检测细胞增殖率,氮蓝四唑（NBT）显色法检测SOD活性,硫代巴比妥酸法测定细胞中MDA的含量,间接法检测细胞中GSH-Px活力,TUNEL和Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,分别用荧光探针DCFH-DA和罗丹明123进行活性氧和线粒体膜电位的检测,western blot检测Caspase-3,9蛋白含量,细胞免疫荧光方法测定Caspase-3蛋白的激活与定位以及Z-VAD-FMK及Ac-LEHD-FMK对细胞凋亡的抑制作用。结果：分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度>97%,且细胞生长状况良好,24h-96h为细胞的对数生长期。高剂量ZEA能抑制猪卵巢颗粒细胞增殖,其IC50为90μM; 60μM,90μM和120μM ZEA均极显著降低抗氧化酶SOD、GSH-Px活性,升高MDA的含量而引起细胞氧化损伤,呈剂量效应相关性；并呈剂量依赖性诱导细胞凋亡；研究揭示ZEA通过caspase依赖性的线粒体凋亡途径诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡,主要表现在：极显著升高细胞内ROS水平,显著性降低线粒体膜电位,激活Caspase-3,9蛋白并诱导Caspase-3从细胞质进入细胞核执行功能,以及caspase抑制剂Z-VAD-FMK与caspase-9抑制剂Ac-LEHD-FMK显著性抑制ZEA所诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡结论：ZEA抑制猪卵巢颗粒细胞增殖,引起细胞氧化损伤,并经由caspase依赖性的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 研究背景
• 2 玉米赤霉烯酮简介
• 2.1 玉米赤霉烯酮的理化性质
• 2.2 玉米赤霉烯酮的代谢
• 3 ZEA的毒性
• 3.1 急性毒性
• 3.2 生殖与发育毒性
• 3.3 免疫毒性
• 3.4 致癌性
• 3.5 遗传毒性
• 3.6 细胞毒性
• 4 卵巢颗粒细胞
• 5 研究目的及意义
• 第二章 猪卵巢细胞的分离培养与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器（见附录）
• 1.2 卵巢颗粒细胞的分离与培养
• 1.3 细胞计数
• 1.4 颗粒细胞形态学观察
• 1.5 颗粒细胞鉴定
• 1.6 细胞生长曲线测定
• 2 结果
• 2.1 颗粒细胞形态学观察
• 2.2 颗粒细胞鉴定
• 2.3 细胞生长曲线测定
• 3 讨论
• 第三章 玉米赤霉烯酮（ZEA）对卵巢颗粒细胞的毒性作用
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器（见附录）
• 1.2 MTT方法测定ZEA对卵巢颗粒细胞的细胞毒性作用
• 1.3 细胞攻毒及分组
• 1.4 SOD、MDA及GSH-Px的测定
• 1.5 细胞凋亡的检测
• 1.6 统计学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ZEA对卵巢颗粒细胞的细胞毒性
• 2.2 细胞中SOD、MDA以及GSH-Px的检测
• 2.3 TUNEL检测细胞凋亡
• 2.4 Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡
• 3.讨论
• 第四章 ZEA诱导卵巢颗粒细胞凋亡机理的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂与仪器（见附录）
• 1.2 活性氧的测定
• 1.3 卵巢颗粒细胞线粒体膜电位的测定
• 1.4 Caspase-3和Caspase-9蛋白含量的检测（western blot）
• 1.5 细胞免疫荧光方法测定Caspase-3蛋白的定位
• 1.6 Z-VAD-FMK及Ac-LEHD-FMK对细胞凋亡的抑制作用
• 1.7 统计学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 活性氧（ROS）检测
• 2.2 线粒体膜电位的检测
• 2.3 Western blot检测Caspase-3,9蛋白含量
• 2.4 ZEA诱导caspase-3激活与易位
• 2.5 Z-VAD-FMK及Ac-LEHD-FMK对凋亡率的影响
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介