论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种中枢神经系统原发性退行性疾病,主要表现为进行性认知功能障碍、学习和记忆能力丧失、个性改变,晚期出现严重痴呆。AD严重影响老年人健康、寿命和生活质量,也给家庭及社会带来巨大负担,已被公认为继心、脑血管疾病和恶性肿瘤之后的人类第四大“杀手”。研究表明,AD在脑内的病变主要累及大脑皮层和海马等与学习、记忆和认知功能有关的区域,其典型的病理特征是脑内出现高密度的以淀粉样β（Amyloidβ, Aβ）蛋白为主要成分的老年斑,包括弥散性斑块和神经炎性斑块。Aβ来源于淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein, APP）的水解,生成后的Aβ由39～43个氨基酸组成,其主要的内源性存在形式是Aβ1-42和Aβ1-40。有证据进一步显示,聚集在斑块中的纤维性Aβ以及在AD脑内呈弥散性分布的可溶性Aβ寡聚体都具有神经毒性作用,其数量与AD的临床症状密切相关。围绕AD病因的“Aβ学说”,近年来治疗AD的一个主要策略就是:减少Aβ的产生和聚集、抑制Aβ的神经毒性、增强Aβ的降解和清除。据此推出的AD免疫治疗,即采用Aβ全分子或其不同肽段作为免疫原进行的AD主动免疫疗法和直接应用抗Aβ抗体进行的被动免疫治疗都已备受关注,并取得了一定的成效。研究表明,对AD动物模型和AD病人进行免疫治疗可以中和可溶性Aβ寡聚体,使Aβ纤维解聚,溶解乃至清除Aβ斑块以至改善AD相关的认知功能障碍。然而,AD免疫疗法中的主动免疫由于临床上出现严重的副作用（6%患者出现脑膜脑炎）而不得不暂时中断;针对Aβ分子的抗体被动免疫虽然也有类似主动免疫清除脑内Aβ斑块的作用,同时也具有出现脑炎和出血的风险。AD免疫治疗出现的副作用可能与免疫原激活了机体的自身免疫反应和抗体引起小胶质细胞发生过度增生有关,也应考虑免疫原本身即具有一定的神经毒性作用。有报道指出,通过脑室内注射抗Aβ抗体的局部被动免疫可以大大地降低炎症反应和出血的风险,同时又避免了主动免疫时出现的自身免疫反应。根据AD的Aβ学说特别是Aβ毒性作用的活性中心研究,我们认为,主动免疫产生的或被动免疫使用的抗Aβ抗体能否有效封闭Aβ发挥神经毒作用的活性中心、中和其神经毒性,以及抗Aβ抗体是否对有助于神经发育的Aβ的前体蛋白APP进行错误识别和攻击,也是影响免疫治疗疗效和产生副作用的重要因素。因此,恰当选择能够特异性结合并封闭Aβ活性中心而又不影响APP的抗Aβ抗体可能成为AD免疫治疗的一个突破口。根据以往报道和我们近年来的研究,Aβ分子的31-35片段,与内源性Aβ以及人工合成的Aβ25-35类似,具有导致体外培养的神经元凋亡、引起神经细胞内钙超载和压抑在体动物海马突触可塑性的作用,提示31-35片段是Aβ发挥神经毒作用的活性中心,有可能成为新的治疗靶点。我们设想,设计并使用特异性的抗Aβ31-35抗体有可能:（1）特异性封闭Aβ活性中心,从而对抗那些从APP上解离下来、并存在于弥散性或神经炎性斑块中的Aβ的神经毒性;（2）避免与APP分子上恰好位于细胞膜跨膜部分的31-35序列结合,从而不影响APP分子正常的生理功能;（3）避免主动免疫时直接使用抗原本身引起的神经毒性;（4）经脑内或脑室内给药,减少抗Aβ抗体外周给药引起的脑血管损伤。为此,本实验将在我们多年来关于Aβ神经毒性作用活性中心研究的基础上,应用特异性的抗Aβ31-35抗体,并通过反映突触传递可塑性变化的在体海马LTP实验、反映学习和记忆功能的动物行为学Morris迷宫实验、反映Aβ神经毒性作用的培养神经细胞活力测定实验,观察抗Aβ31-35抗体能否对抗Aβ1-42引起的神经毒性作用,从而为AD免疫学治疗提供一个针对性更强、更有效,也可能是更安全的被动免疫策略。实验分以下三部分进行。第一部分:抗Aβ31-35抗体保护大鼠在体海马长时程增强免受Aβ1-42引起的伤害本实验通过急性侧脑室内注射Aβ1-42和抗Aβ31-35抗体并记录海马场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential, fEPSP）,观察了Aβ1-42和抗Aβ31-35抗体以及二者联合应用对大鼠海马CA 1区在体LTP的影响,旨在探讨抗Aβ31-35抗体拮抗Aβ神经毒性作用的LTP保护效应。实验采用雄性Wistar大鼠,麻醉后将其固定在脑立体定位仪上,分别将脑室套管和绑定的同心圆双极刺激电极和单极记录电极,精确插入到侧脑室和海马刺激与记录部位。通过给予海马Schaffer侧枝单个电刺激、高频刺激（high frequency stimulation, HFS）和双脉冲刺激,在海马CA1区放射层诱发和记录基础的fEPSP、HFS引起的fEPSP的长时程增强即LTP、以及配对脉冲引起的双脉冲易化（paired pulse facilitation, PPF）。经脑室套管向侧脑室内注射Aβ1-42和抗Aβ31-35抗体,观察各种药物对基础fEPSP、LTP以及PPF的影响。结果显示:（1）脑室内Aβ1-42预处理不影响基础的突触传递,但显著地抑制了高频刺激引起的海马在体LTP。给予HFS后1 min,30 min和60 min时,对照组（磷酸缓冲液,PBS）fEPSPs幅度分别增加至213.7±6.0%, 175.9±6.3%和166.3±7.1%,表现出明显的LTP效应;而Aβ1-42预处理30 min并给予HFS后,fEPSPs幅度分别降至162±7.6%, 126.5±6.7%和114±5.4%（p<0.01）,表明Aβ1-42强烈抑制了海马在体LTP。（2）抗Aβ31-35抗体本身预处理既不影响基础的突触传递又不影响高频刺激诱导的海马在体LTP。给予HFS后1,30和60 min后,5 nmol抗Aβ31-35抗体组的fEPSPs幅度分别升高至220.6±7.4%, 177±5.9%和166.1±7.0%,与对照组相比,没有明显的统计学差异（p>0.05）。（3）侧脑室联合应用不同浓度的抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42后,基础的突触传递没有明显变化,但Aβ1-42诱导的海马LTP的压抑被剂量依赖性地阻断。其中,0.05 nmol抗Aβ31-35抗体预处理后,对Aβ1-42诱导的LTP压抑几乎没有作用。HFS后1, 30和60 min时,fEPSPs的幅度分别为167±6.3%, 126.6±4.9%和112±6.7%,与单独给予Aβ1-42组相比,没有明显的统计学差异（p>0.05）。联合应用0.5 nmol抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42后,被压抑的LTP发生了中等程度的逆转。HFS后1,30和60 min时, fEPSPs的幅度分别为190.3±7.5%, 155.8±7.5%和142.6±5.9%,明显高于单纯Aβ1-42组（p<0.05）。5 nmol抗Aβ31-35抗体预处理后,海马LTP完全不再受到Aβ1-42压抑。HFS后1,30和60 min时,fEPSPs的幅度从Aβ1-42组的162±7.6%, 126.5±6.7%和114±5.4%分别升高至225±9.3%, 180.6±7.7%和163.3±6.5%。两组相比,差异明显（p<0.01）。（4）双脉冲易化（PPF）实验中,对照组、Aβ1-42组以及抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42联合应用组均未见PPF值发生明显的改变。以上结果表明,抗Aβ31-35抗体能够保护在体海马CA1区LTP免受Aβ1-42引起的伤害,提示31-35片段可能是Aβ发挥神经毒性作用的更小的活性片段和新的治疗靶点;鉴于抗Aβ31-35抗体本身对LTP无影响,因此抗Aβ31-35抗体有可能成为一种新的较为安全的AD免疫治疗方案。第二部分:抗Aβ31-35抗体对Aβ1-42引起的大鼠空间学习、记忆行为障碍的影响该部分实验通过使用Morris水迷宫测试方法,观察了慢性侧脑室内注射Aβ1-42和抗Aβ31-35抗体对大鼠空间学习、记忆能力的影响,并进一步检查了不同浓度的抗Aβ31-35抗体预处理对Aβ1-42所致大鼠空间学习、记忆能力伤害的影响。实验选用反应灵活、无视觉和运动障碍的雄性Wistar大鼠,麻醉后在脑立体定位仪导引下,应用微量注射器将相同容积的Aβ1-42和/或抗Aβ31-35抗体等药物缓慢注入右侧侧脑室,待动物清醒并恢复两周后,进行Morris水迷宫行为学测试。测试分三部分进行:定位航行实验,空间探索实验和可见平台实验。主要观察各种药物处理对大鼠逃避潜伏期、游泳距离、大鼠处于正确（即平台所在）象限所占的时间和距离百分比,以及大鼠游泳速度的影响。结果显示:（1） Aβ1-42能够显著降低大鼠的空间学习和记忆能力。注射5 nmol Aβ1-42后,在测试开始后的第1,2,3和4天,大鼠逃避潜伏期分别为93.1±6.1 s, 79.6±5.8 s, 60.3±6.0 s和45.5±6.5 s,明显长于PBS对照组的62.5±5.9 s, 41.7±6.5 s, 22.4±6.0 s和9.8±5.5 s （p<0.01）。大鼠找到平台所游过的距离也明显大于对照组,在测试开始后的第1,2,3和4天,分别为2185.1±143.2 cm,1868.2±136.1 cm,1415.2±140.8 cm和1067.9±152.6 cm,明显长于对照组的1609.0±161.9 cm,1073.8±167.4 cm,576.8±154.5 cm和252.4±141.6 cm （p<0.01）。在第5天的空间探索实验中,注射了Aβ1-42的大鼠处于正确象限的时间和游过距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为37.6±2.3%和35.6±4.0%,明显短于对照组的50.2±3.1%和49.8±2.9% （p<0.01）。（2）抗Aβ31-35抗体本身不影响大鼠的空间学习和记忆能力。注射5 nmol抗Aβ31-35抗体后,在测试的1,2,3和4天,大鼠的逃避潜伏期分别为67.4±5.6 s, 46.7±6.0 s, 24.6±6.3 s和13.9±5.5 s,找到平台所游过的距离分别为1760.5±146.3 cm,1219.8±156.7 cm,642.6±164.6 cm和363.1±143.7 cm,与对照组相比,没有明显的统计学差异（p>0.05）。在第5天的空间探索实验中,注射了抗Aβ31-35抗体的大鼠处于正确象限的时间和游过距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为48.5±2.8%和50.0±3.3%,与对照组相比无明显差异（p>0.05）。（3）大剂量的抗Aβ31-35抗体能够改善Aβ1-42诱发的大鼠空间学习和记忆能力损伤。0.05 nmol抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42联合应用后,对Aβ1-42诱发的大鼠学习记忆能力损伤没有明显的改善作用。大鼠的逃避潜伏期和距离在测试的4天中分别为98.3±5.9 s, 75.8±6.4 s, 59.3±6.6 s和40.4±6.0 s以及2325.0±148.6 cm,1958.6±161.2 cm,1257.2±166.2 cm和1017.3±151.1 cm,处于正确象限的时间和游过距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为38.4±2.0%和36.0±3.0%,与Aβ1-42组相比,没有明显的统计学差异（p>0.05）。然而,联合应用0.5 nmol抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42后,在测试的第1,2,3和4天,大鼠的逃避潜伏期以及找到平台游过的距离分别减少为64.0±6.3 s, 43.2±5.9 s, 27.1±6.5 s和11.9±5.4 s以及1663.0±173.6 cm,1190.6±162.6 cm,746.9±179.1 cm和328.0±148.8 cm;应用5 nmol抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42后,潜伏期分别为59.4±6.5 s, 40.8±5.7 s, 28.7±7.0 s和13.0±6.0 s,游过的距离分别为1543.4±216.0 cm,1091.44±162.6 cm,697.4±170.1 cm和315.9±145.8 cm。与0.05 nmol抗体组和Aβ1-42组相比,具有显著差异（p<0.01）;与对照组相比,已没有明显的统计学意义（p>0.05）。在第5天的空间探索实验中,0.5 nmol和5 nmol抗Aβ31-35抗体与Aβ1-42联合应用后,大鼠处于正确象限的游泳时间和距离占总时间和总距离的百分比分别为51.3±1.4%和51.6±2.5% （0.5 nmol）,以及49.0±3.0%和48.7±1.8% （5 nmol）,与对照组相比,三组之间没有明显的统计学差异（p>0.05）,但与0.05 nmol抗体组和Aβ1-42组相比,明显增加（p<0.01）。（4） Aβ1-42、抗Aβ31-35抗体以及二者的联合应用均未影响大鼠的视力和游泳速度。以上结果表明:抗Aβ31-35抗体本身对大鼠的学习和记忆能力没有影响,却能明显改善Aβ1-42诱发的大鼠空间学习、记忆能力障碍。这也提示,31-35片段可能是Aβ发挥神经毒性作用的更小的活性片段和新的治疗靶点,而抗Aβ31-35抗体有可能成为一种新的治疗AD的药物。5第三部分:抗Aβ31-35抗体保护培养的大鼠皮层神经元免受Aβ1-42的伤害本实验观察了Aβ1-42和抗Aβ31-35抗体以及二者联合应用对原代培养的大鼠皮层神经元生存能力的影响。培养的原代皮层神经元来自新生的Wistar大鼠,急性分离后常规培养,于接种后3天加阿糖胞苷以抑制胶质细胞的增殖,培养8-10天待神经元成熟后加入Aβ1-42或抗Aβ31-35抗体或二者联合给予,孵育24 h后进行细胞活力（CCK-8）测定,乳酸脱氢酶（LDH）含量测定和confocal细胞成像检查。结果可见:（1）抗Aβ31-35抗体单独孵育对培养的大鼠皮层神经元没有影响,但却剂量依赖性地阻断了Aβ1-42引发的神经毒性作用。在CCK-8细胞活力测定中,单独使用20μM Aβ1-42孵育24 h后,CCK-8测试值（%对照）从对照组的100%降至42.6±4.7% （p<0.01）;单独使用20μM抗Aβ31-35抗体孵育后,CCK-8测试值为97.3±3.9% （p>0.05）;联合孵育5、10或20μM抗Aβ31-35抗体和20μM Aβ1-42后,CCK-8测试值分别为48.7±5.2%,66.8±3.5%和98.5±4.1%,与单独Aβ1-42给药组相比,5μM抗Aβ31-35抗体未见明显的差异（p>0.05）,而10μM （p<0.05）或20μM （p<0.01）抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42共同给药组皆有统计学差异。（2）在LDH含量测定实验中,抗Aβ31-35抗体也能剂量依赖性阻断Aβ1-42引发的细胞LDH释放。20μM Aβ1-42单独预处理24 h后,LDH释放值（%对照）从对照组的100%增至157.1±3.6% （p<0.01）;20μM抗Aβ31-35抗体预处理24 h后,LDH释放值为103.5±4.2% （p>0.05）;5,10或20μM抗Aβ31-35抗体和20μM Aβ1-42联合预处理后,LDH释放值分别为150.2±4.5%,123.9±4.0%和101.9±5.1%,与Aβ1-42单独给药组相比,5μM抗Aβ31-35抗体相差不明显（p>0.05）,10μM （p<0.05）或20μM （p<0.01）抗Aβ31-35抗体和Aβ1-42共同给药组均有统计学差异。（3）抗Aβ31-35抗体剂量依赖性地阻断了Aβ1-42引发的细胞存活率的下降。单独应用20μM Aβ1-42 24 h后,细胞存活率（%）从对照组的99.1±0.8%降至41.0±4.0% （p<0.01）;应用20μM抗Aβ31-35抗体后,细胞存活率仍保持在98.2±1.5% （p>0.05）;联合应用5,10或20μM抗Aβ31-35抗体和20μM Aβ1-42后,细胞存活率分别为45.3±4.2%, 63.4±2.9%和98.8±1.0%,与单独应用Aβ1-42组相比,5μM抗Aβ31-35抗体没有明显的差异（p>0.05）,10μM （p<0.05）和20μM （p<0.01）抗Aβ31-35抗体与Aβ1-42共同应用组皆有统计学差异。该结果表明:抗Aβ31-35抗体本身对原代培养的大鼠神经元没有影响,却能够剂量依赖性地阻断Aβ1-42诱发的细胞毒性,发挥保护细胞作用。这提示31-35片段可能是Aβ发挥神经毒性作用的更小的活性片段和新的治疗靶点,抗Aβ31-35抗体在细胞水平上没有毒、副作用产生,却能有效发挥抗Aβ的神经保护效应。综合以上实验,本研究利用电生理细胞外场电位记录、动物Morris水迷宫行为学实验和培养大鼠皮层神经元活力测定技术,观察了Aβ1-42、抗Aβ31-35抗体以及二者联合应用对大鼠海马在体LTP、大鼠空间学习记忆能力和培养大鼠皮层神经元细胞活力等的影响。研究结果证实,抗Aβ31-35抗体能够有效地对抗Aβ1-42所致的大鼠海马LTP压抑、空间学习记忆能力下降和皮层培养神经元的损伤。这些结果不仅为31-35序列可能是Aβ发挥神经毒性作用的最小活性中心这一推论提供了有力证据,更为AD的免疫治疗提供了一个针对性更强、更有效,也可能是更安全的治疗策略。
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