论文摘要
心脏是需要持续能量供应的高耗能器官,它的能量代谢失衡将引起一系列病理生理及形态学变化,研究表明能量代谢障碍贯穿在心肌从代偿性肥厚直到发生功能衰竭的全过程中,能量代谢障碍是心肌肥厚发展为心衰的重要因素。中医研究发现心气虚证在心衰之前就已经存在,并贯穿于心肌肥厚和心衰始终,心气虚证进一步加重可以导致阳虚、血瘀、水停等其他证候而引起心衰的发生发展和恶化,这与能量代谢障碍贯穿于心肌肥厚和心衰的始终并促进其发生发展具有相似之处。既往研究表明心气虚证与心功能的减低密切相关,补气药黄芪、党参等是治疗心衰的有效药物,黄芪对心衰、缺血缺氧、再灌注损伤和病毒损伤的心肌,具有保护心肌线粒体结构、提高生物氧化相关的多种酶的活性、减少乳酸脱氢酶外漏等作用,从而改善心肌能量代谢。本课题在大量文献整理、分析及既往研究工作的基础上,在细胞及分子水平,从心肌细胞能量代谢研究着手,验证中医“心衰以气虚为本”的学说,更好地辨析黄芪防治心衰的机理,探寻黄芪改善能量代谢的关键作用环节。课题实验研究分为两部分。第一部分为基础,观察黄芪组分对肥大心细胞线粒体活力的干预作用;第二部分为核心,探讨黄芪组分对肥大心细胞能量代谢的干预作用及作用的关键环节。方法1第一部分体外原代培养乳鼠心肌细胞,分为对照组（Control）、肥大模型组（M）、黄芪皂苷组（AS）和黄芪多糖组（APS）,采用四氮唑盐比色法,在48h观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及不同浓度梯度的黄芪皂苷和黄芪多糖对线粒体琥珀酸脱氢酶活力的影响,确定最适宜的黄芪皂苷和黄芪多糖浓度;观察其在12h、24h、48h、72h、96h对线粒体琥珀酸脱氢酶活力的影响曲线。2第二部分体外原代培养乳鼠心肌细胞,实验分为6组:对照组（Control）、肥大模型组（M）、络沙坦组（L）、黄芪皂苷组（AS）、黄芪多糖组（APS）和皂苷多糖组（AS+APS）,在AngⅡ致乳鼠心肌细胞肥大模型基础上,于24h和48h分别采用高效液相色谱分析法（HPLC）观察AngⅡ对ATP含量的影响及黄芪组分的干预作用;采用寡霉素抑制无机磷定量法观察ATP合成酶活性及黄芪组分的干预作用;采用生化法和高速电泳法（REP）观察AngⅡ对总肌酸激酶（CK）活性、同功酶组成的影响及黄芪组分的干预作用;采用RT-PCR法观察AngⅡ对ATP合成酶F1亚单位β肽（F1-ATPaseβ）和CK同功酶mRNA表达的影响,同时观察黄芪组分的干预作用。结果1浓度为10-2g·L-1的黄芪注射液和浓度为10-2g·L-1的注射用黄芪多糖能起到更有益的干预作用;AngⅡ作用12h,心肌细胞蓝紫色结晶物formazan产物的光吸收值（OD）无明显变化,24h显著增加,至48h开始下降,72h下降更明显,至96hOD值仍偏低,但与正常组比较无显著性差异。黄芪组分干预后,12hOD值无明显改变、24hOD值显著增加,48h、72h及96hOD值趋于正常,与模型组有显著性差异。2 AngⅡ作用24h,引起心肌细胞F1-ATPaseβ表达增加,ATP含量无变化;48h引起F1-ATPaseβ表达下降,ATP含量增加,ATPase活性24h和48h无变化。黄芪组分干预后24h,心肌细胞F1-ATPaseβ表达增加,ATP含量无变化,干预48h,F1-ATPaseβ表达趋于正常,ATP含量高于正常组,低于模型组,均有显著性差异。3 AngⅡ作用24h,引起心肌细胞CK-B表达增加、CK-M表达降低, CK-BB所占比例增加、CK-MM减少,总CK活性下降;48h持续上述变化。mi-CK表达在24h、48h无变化,CK同功酶组成分析中未见mi-CK条带,CK-MB比例无变化。黄芪组分干预后24h,与单纯AngⅡ作用结果基本相同,干预后48h,CK-B和CK-M表达、CK-BB和CK-MM所占比例以及总CK活性均趋于正常。结论AngⅡ可引起心肌细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活力的动态变化,引起心肌细胞ATP合成酶、CK同功酶表达的变化以及CK同功酶活性和ATP含量的变化,提示AngⅡ能够诱导心肌细胞能量代谢物质及代谢相关酶的变化从而导致能量代谢的障碍,黄芪组分可以在不同程度上抑制AngⅡ的上述作用。AngⅡ致肥大心肌细胞模型的能量代谢变化过程,符合心力衰竭从代偿到失代偿的过程,符合心气虚的症状表现。黄芪对心力衰竭的防治正是通过改善心肌能量代谢而达到补益心气、化瘀行水的作用。黄芪改善肥大心肌细胞能量代谢的机制之一是抑制AngⅡ引起的能量代谢障碍,其关键可能在于影响能量代谢相关酶的表达。