甘蔗花叶病与黄叶病RNAi双价抗病毒表达载体构建与遗传转化研究

论文摘要

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是甘蔗世界流行性病毒病。由于传统的防治方法很难抵制它们的侵染,感病甘蔗的生长严重受阻,从而导致甘蔗产量下降和品质变差,化学防治方法也难以奏效且污染环境大,因此,培育稳定遗传和持久抗性的新品种是抗病毒甘蔗的最佳选择。甘蔗遗传背景复杂,常规育种方法不仅周期长,而且难以培育抗病甘蔗品种,选育兼抗甘蔗黄叶病和花叶病甘蔗品种更加困难。随着基因组学的发展,尤其是RNA干扰技术的产生,利用分子生物学方法创制抗病毒甘蔗品种成为可能。本论文结合RNA干扰技术,基于甘蔗黄叶病和花叶病的病毒结构与功能的特性,选取甘蔗黄叶病外壳蛋白CP基因和甘蔗花叶病的辅助成分蛋白HC-Pro基因及外壳蛋白CP基因的保守序列作为干扰序列。通过引入酶切位点Xba I分别连接甘蔗黄叶病和花叶病毒保守序列获得双价干扰序列,然后将双价干扰序列构建到中间克隆载体pHANNIBAL上,形成可产生ihpRNA结构的序列,并构建到载体pART27形成干扰表达载体,通过农杆菌介导和基因枪轰击的方法获得双价抗病新品种。本论文的主要研究成果： （1）分别成功构建三种甘蔗黄叶病和花叶病毒双价RNAi表达载体,即pART27-MC1Y、pART27-MC2Y和pART27-MPY,并转化农杆菌获得三种工程菌株。（2）通过G418抗性筛选,确定了甘蔗品种ROC22和FN28的G418筛选浓度,在甘蔗愈伤组织分化期为30m g/L,在分化苗生长期,筛选浓度为40 mg/L。 （3）通过基因枪轰击和农杆菌介导,分别获得转三种双价RNAi序列阳性植株群体,经抽样分子检测,筛选到19株转基因植株。其中通过农杆菌介导转化获得6株,转MClY干扰序列3株,占检测群体的2.069%；转MC2Y干扰序列1株,占检测群体的2.273%；转MPY干扰序列2株,占检测群体的2.985%；通过基因枪介导转化获得13株,其中MClY干扰序列7株占,检测群体的5.263%；转MC2Y干扰序列2株占检测群体的2.899%；转MPY干扰序列4株,占检测群体的5.0%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 甘蔗花叶病国内外研究进展
• 1.1.1 甘蔗花叶病发生
• 1.1.2 甘蔗花叶病危害
• 1.1.3 甘蔗花叶病病征
• 1.1.4 甘蔗花叶病毒结构
• 1.1.5 甘蔗花叶病毒分类
• 1.1.6 甘蔗花叶病毒基因组与功能
• 1.1.7 甘蔗花叶病毒HC-Pro基因与CP基因抗病性
• 1.2 甘蔗黄叶病国内外研究进展
• 1.2.1 甘蔗黄叶病发生
• 1.2.2 甘蔗黄叶病危害
• 1.2.3 甘蔗黄叶病病征
• 1.2.4 甘蔗黄叶病毒结构
• 1.2.5 甘蔗黄叶病毒分类
• 1.2.6 甘蔗黄叶病毒基因组与功能
• 1.2.7 甘蔗黄叶病毒CP基因抗病性
• 1.3 甘蔗抗病毒病育种方法
• 1.3.1 常规育种
• 1.3.2 分子育种
• 1.4 甘蔗遗传转化方法
• 1.4.1 农杆菌介导法
• 1.4.2 基因枪转化法
• 1.4.3 电击法
• 1.4.4 聚乙二醇（PEG）介导法
• 1.5 国内外植物RNA干扰转基因育种研究进展
• 1.5.1 RNAi原理及对植物抗病毒育种的特殊意义
• 1.5.2 植物RNA干扰片段的特点
• 1.5.3 植物dsRNA导入方法
• 1.6 目的和意义
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究意义
• 1.7 本研究的研究思路
• 2 实验材料与实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 植物受体材料
• 2.1.3 实验试剂与实验仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 甘蔗花叶病毒序列比对与干扰序列
• 2.2.2 甘蔗黄叶病毒序列比对与干扰序列
• 2.2.3 RNAi表达载体构建
• 2.2.4 目的片段回收
• 2.2.5 酶切回收片段
• 2.2.6 双价目的片段酶连接
• 2.2.7 双价目的片段RNAi表达载体构建
• 2.2.8 农杆菌工程菌获得与鉴定
• 2.2.9 甘蔗愈伤诱导
• 2.2.10 受试品种抗生素G418筛选浓度测定
• 2.2.11 农杆菌介导转化
• 2.2.12 基因枪转化
• 2.2.13 甘蔗抗性幼苗的生根培养与炼苗
• 2.2.14 幼苗移栽
• 2.2.15 转基因植株分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 甘蔗花叶病毒分离物序列比对与干扰序列
• 3.1.1 甘蔗花叶病毒分离物序列比对
• 3.1.2 甘蔗花叶病毒干扰序列
• 3.2 甘蔗黄叶病毒序列比对与干扰序列
• 3.2.1 甘蔗黄叶病毒序列比对
• 3.2.2 甘蔗黄叶病毒干扰序列
• 3.3 RNAi表达载体构建
• 3.3.1 干扰序列引物设计
• 3.3.2 干扰序列的获得与克隆
• 3.3.3 目的片段回收
• 3.3.4 酶切回收片段
• 3.3.5 双价目的片段酶连接
• 3.3.6 双价目的片段RNAi表达载体构建过程
• 3.3.7 构建含有目的片段正反重复序列载体
• 3.4 农杆菌工程菌获得与鉴定
• 3.5 甘蔗愈伤诱导
• 3.6 受试品种抗生素G418筛选浓度测定
• 3.7 农杆菌介导抗性愈伤组织筛选与分化
• 3.8 基因枪轰击
• 3.8.1 基因盒的制备
• 3.8.2 微弹包被验证
• 3.8.3 抗性甘蔗愈伤组织筛选与分化
• 3.9 甘蔗抗性幼苗生根及炼苗
• 3.10 幼苗移栽
• 3.11 转基因植株检测
• 4 讨论
• 4.1 AS对农杆菌介导甘蔗遗传转化的作用
• 4.2 NPTII筛选抗生素对甘蔗抗性苗筛选的影响
• 4.3 微量碱裂解制备模板
• 5 结论
• 6 后续工作
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 致谢