南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341产适冷蛋白酶及低温适应性的研究

论文摘要

南极具有独特的地理及气候特征,其主要特点是变化极大的光照辐射、季节性的光照时间;常年极低的水温（通常在–1.8℃2.0℃）,在冬季最低温度可以达到–50℃;高盐度环境（海水中的盐度一般为34‰35‰）,海冰中的盐囊和盐通道的盐度可达到150‰,因此形成了一个酷寒、强辐射和高盐度的自然环境。为了适应极端的环境,生存于其中的微生物必然具备了相应独特的生理生化和分子机制。因此南极微生物不仅是研究在低温条件下生物适应性的极好材料,而且也是获得在低温条件下具有较大催化能力的适冷酶类的最佳来源。对南极微生物及其产生适冷酶的研究有着重要的生物学意义;同时,由于适冷酶能在低温下有效发挥催化作用的特点,在生物工程领域有着广阔的应用前景。本研究以南极海冰嗜冷菌Colwellia sp.NJ341为研究对象,对该菌株分泌的胞外适冷丝氨酸蛋白酶进行系统的研究,同时对该菌株的低温适应性也予以初步探讨,以期为南极微生物的深入研究和开发应用提供科学依据。（1）采用水解酪蛋白平板法对本试验室保存的260株南极低温微生物产适冷蛋白酶情况进行测定,发现107株具有蛋白酶活性,其中5株菌（NJ276、NJ341、NJ16-70、NJ345、NJ5-9）所产的蛋白酶活性高于45 U/ml。除NJ5-9菌株外,对其余4株菌所产蛋白酶的部分酶学特性进行研究,发现蛋白酶的酶学性质及酶的种类和数量在种间存在差异。菌株NJ276、NJ16-70分泌的蛋白酶接近中温蛋白酶,NJ341、NJ345分泌的蛋白酶属于适冷蛋白酶。随后,对5株菌进行了16S rRNA分子鉴定,菌株NJ276、NJ5-9、NJ16-70、NJ345均属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）;菌株NJ341属于科尔韦尔氏属（Colwellia sp.）。（2）以国内外研究较少且只分泌一种适冷蛋白酶的嗜冷菌Colwellia sp.NJ341作为研究材料,进行酶的优化培养、分离纯化及酶学性质的研究。结果表明,菌株NJ341发酵培养基的初始pH和通气量的最适值,分别为pH79和50120

论文目录

• 独创声明
• 学位论文版权使用授权书
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 南极微生物多样性
• 1.2 南极微生物活性物质的研究
• 1.3 南极微生物适冷酶研究进展
• 1.3.1 南极微生物适冷酶种类
• 1.3.2 适冷酶催化特性
• 1.3.3 重组适冷酶
• 1.3.4 适冷酶的结构特性
• 1.3.5 低温催化与酶分子结构
• 1.4 适冷蛋白酶的研究进展
• 1.4.1 蛋白酶的分类
• 1.4.2 适冷蛋白酶来源与种类
• 1.4.3 适冷蛋白酶酶学特征
• 1.4.3.1 低温促进微生物分泌更多蛋白酶
• 1.4.3.2 适冷蛋白酶的最适作用温度低
• 1.4.3.3 适冷蛋白酶的热稳定性差
• 1.4.3.4 适冷蛋白酶的活化能低
• 1.4.4 重组适冷蛋白酶
• 1.4.5 适冷蛋白酶的结构特征
• 1.4.6 适冷蛋白酶的应用
• 1.5 低温微生物的适冷机制
• 1.5.1 适冷酶的分泌
• 1.5.2 调节膜脂组分
• 1.5.3 低温微生物的适冷代谢机制
• 1.5.4 冷激蛋白和抗冻蛋白的合成
• 1.5.5 其它细胞可溶性物质
• 1.6 我国低温微生物和适冷酶的研究状况
• 2 南极微生物产低温蛋白酶菌株的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 菌株培养和胞外蛋白酶提取
• 2.1.4 产低温蛋白酶菌株筛选
• 2.1.5 蛋白酶活力测定
• 2.1.6 菌株生长和产酶曲线的测定
• 2.1.7 温度对菌株生长和产酶影响的测定
• 2.1.8 蛋白酶部分酶活特性的测定
• 2.1.8.1 蛋白酶最适pH 测定
• 2.1.8.2 蛋白酶最适温度测定
• 2.1.8.3 蛋白酶的热稳定性测定
• 2.1.9 蛋白酶酶谱（Zymograms）
• 2.2 结果
• 2.2.1 南极微生物产蛋白酶菌株的筛选
• 2.2.2 4株产蛋白酶南极嗜冷菌生长及部分酶学特性
• 2.2.2.1 温度对4 株产蛋白酶南极嗜冷菌生长及产蛋白酶的影响
• 2.2.2.2 4 株产蛋白酶南极嗜冷菌生长和产酶曲线
• 2.2.2.3 4 株南极嗜冷菌分泌蛋白酶的酶学特性
• 2.2.3 4 株南极嗜冷菌产蛋白酶酶谱分析
• 2.3 讨论
• 2.4 结语
• 3 5 株产蛋白酶南极嗜冷菌的16S rRNA 分子鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 5 株南极嗜冷菌16S rRNA 基因序列测定
• 3.1.2.1 细菌培养及菌体收集
• 3.1.2.2 菌株基因组DNA 的提取（CTAB 方法）
• 3.1.2.3 DNA 电泳鉴定、纯度及浓度的测定
• 3.1.2.4 引物设计
• 3.1.2.5 PCR 扩增
• 3.1.2.6 PCR 产物的纯化
• 3.1.2.7 T-A 克隆
• 3.1.2.8 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 3.1.2.9 阳性克隆的筛选
• 3.1.2.10 质粒的酶切检验
• 3.1.2.11 序列分析及数据处理
• 3.1.3 菌株NJ341 的表型特征
• 3.1.3.1 形态学特征
• 3.1.3.2 菌种鉴定
• 3.1.3.3 脂肪酸分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 16S rRNA 基因的PCR 扩增及T-A 克隆、测序结果
• 3.2.2 5 株产蛋白酶嗜冷菌16S rRNA 基因序列和系统发育学分析
• 3.2.3 菌株NJ341 的表型特征鉴定
• 3.3 讨论
• 3.4 结语
• 4 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 产适冷蛋白酶的优化培养
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 嗜冷菌C.sp.NJ341 产适冷蛋白酶的优化培养
• 4.1.2.1 通气量对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定
• 4.1.2.2 初始pH 值对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定
• 4.1.2.3 盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产蛋白酶影响的测定
• 4.1.2.4 最适氮源和碳源种类的筛选
• 4.1.2.5 金属离子和表面活性剂对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶影响的测定
• 4.1.2.6 氨基酸对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶影响的测定
• 4.1.3 响应面分析法（RSM）实验设计
• 4.1.4 菌株的生长和产蛋白酶曲线的测定
• 4.1.6 产酶稳定性试验
• 4.2 结果
• 4.2.1 通气量和初始pH 值对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产酶的影响
• 4.2.2 盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和产酶的影响
• 4.2.3 氮源和碳源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产酶的影响
• 4.2.4 金属离子、表面活性剂和氨基酸对嗜冷菌C.sp.NJ341 产酶的影响
• 4.2.5 利用响应面法对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶优化培养
• 4.2.6 嗜冷菌C.sp.NJ341 的生长和产蛋白酶曲线
• 4.2.7 嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶稳定性
• 4.3 讨论
• 4.3.1 氮源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响
• 4.3.2 碳源对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响
• 4.3.3 盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶的影响
• 4.3.4 利用响应面法对嗜冷菌C.sp.NJ341 产蛋白酶优化条件
• 4.4 结语
• 5 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 产适冷蛋白酶的分离纯化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 培养基与培养
• 5.1.3 纯化方法
• 5.1.3.1 硫酸铵盐析
• 5.1.3.2 DEAE-Sephadex A50 柱层析
• 5.1.3.3 Sephadex G-75 柱层析
• 5.1.3.4 DEAE-Sepharose Fast Folw 柱层析
• 5.1.4 蛋白质含量的测定
• 5.1.5 蛋白质的电泳
• 5.1.6 蛋白酶酶谱（Zymograms）
• 5.1.7 高效液相色谱（HPLC）对蛋白酶纯度的鉴定
• 5.1.8 MALDI-TOF MS 对纯化蛋白酶的分子量测定
• 5.1.9 纯化蛋白酶的肽指纹图谱鉴定
• 5.2 结果
• 5.2.1 适冷蛋白酶的纯化
• 5.2.1.1 硫酸铵沉淀
• 5.2.1.2 DEAE-Sephadex A50 离子交换
• 5.2.1.3 Sephadex G-75 凝胶过滤
• 5.2.1.4 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换
• 5.2.2 HPLC 对纯化后蛋白酶纯度的鉴定结果
• 5.2.3 蛋白酶的分子量
• 5.2.4 纯化后蛋白酶的肽指纹图谱分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 适冷蛋白酶的纯化
• 5.3.2 适冷蛋白酶分子量测定及肽指纹图谱分析
• 5.4 结语
• 6 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 适冷蛋白酶酶学性质的研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 蛋白酶活力的测定
• 6.1.2.2 不同温度下蛋白酶活力的测定
• 6.1.2.3 不同pH 值下蛋白酶活力的测定
• 6.1.2.4 不同NaCl 浓度下蛋白酶的活力的测定
• 6.1.2.5 金属离子、表面活性剂和抑制剂等物质对蛋白酶活力影响的测定
• 6.1.2.6 蛋白酶动力学常数测定
• 6.1.2.7 蛋白酶酶解效果的测定
• 6.2 结果
• 6.2.1 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 的蛋白酶活力
• 6.2.2 不同pH 下嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的活力
• 6.2.3 不同NaCl 浓度下嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的活力
• 6.2.4 抑制剂和金属离子对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响结果
• 6.2.5 嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的动力学性质
• 6.2.6 嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶酶解效果
• 6.3 讨论
• 6.3.1 温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响
• 6.3.2 pH 对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响
• 6.3.3 盐度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响
• 6.3.4 抑制剂和金属离子对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白酶的影响
• 6.3.5 嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶动力学常数
• 6.3.6 嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶酶解效果
• 6.4 结语
• 7 南极嗜冷菌Colwellia sp.NJ341 低温适应性的研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料与培养基
• 7.1.2 温度设定
• 7.1.3 菌株的生长测定
• 7.1.4 细胞内蛋白质含量的测定
• 7.1.5 蛋白质样品的制备
• 7.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
• 7.1.7 双向凝胶电泳分离
• 7.1.7.1 第一向等电聚焦（Isoelectric focusing）
• 7.1.7.2 IPG 胶条的平衡
• 7.1.7.3 第二向SDS-PAGE
• 7.1.7.4 蛋白质点的采集与分析
• 7.1.8 质谱样品的制备和质谱鉴定
• 7.1.8.1 Coomassie Stained 胶内消化
• 7.1.8.2 质谱分析
• 7.1.8.3 数据的分析和比对
• 7.1.9 谷胱甘肽硫转移酶（GST）活力的测定
• 7.1.10 丙二醛（MDA）含量的测定
• 7.1.11 细胞脂肪酸的分析
• 7.2 结果
• 7.2.1 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 生长和细胞内蛋白质含量
• 7.2.2 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白表达的SDS-PAGE
• 7.2.3 嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白质双向电泳
• 7.2.4 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 细胞内蛋白表达的双向电泳
• 7.2.5 差异蛋白点a 和c 的鉴定结果
• 7.2.6 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341GST 活力
• 7.2.7 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341MDA 含量
• 7.2.8 不同温度下嗜冷菌C.sp.NJ341 脂肪酸含量
• 7.3 讨论
• 7.3.1 温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 蛋白质含量的影响
• 7.3.2 冷激蛋白与嗜冷菌C.sp.NJ341 低温适应性关系
• 7.3.3 谷胱甘肽硫转移酶与嗜冷菌C.sp.NJ341 低温适应性关系
• 7.3.4 温度对嗜冷菌C.sp.NJ341 脂肪酸含量的影响
• 7.4 结语
• 8 结论
• 8.1 南极微生物产适冷蛋白酶菌株的筛选
• 8.2 5 株南极微生物产蛋白酶菌株的16S rRNA 分子鉴定
• 8.3 南极嗜冷菌C.sp.NJ341 产适冷蛋白酶发酵优化培养
• 8.4 南极嗜冷菌C.sp.NJ3411 产适冷蛋白酶的分离纯化
• 8.5 南极嗜冷菌C.sp.NJ341 适冷蛋白酶的酶学性质
• 8.6 南极嗜冷菌C.sp.NJ341 对低温的适应性
• 参考文献
• 攻读博士期间发表文章
• 致谢