论文摘要
前言糖尿病是病人及其家庭的沉重负担,对该病的治疗也是医学界长久以来的一个难题。约30～50%以上的糖尿病病人会出现的并发症,进而导致生活质量降低,生存时间缩短,医药费增加。糖尿病病人持续的高血糖是发生并发症的决定性危险因素。目前,保持长期稳定的正常血糖,同时避免低血糖危险的唯一途径,就是替换病人的胰岛:包括带血管的胰腺移植,或者注射纯化的胰岛细胞。在最近的20年,胰腺移植治疗糖尿病效果显著——能够预防和逆转糖尿病并发症,改善生活质量,延长生存时间,而且医疗费用有所减少。胰腺移植的成功提示,在长期的非特异性免疫抑制状态下,胰岛β细胞替代治疗效果确切。胰岛移植属于细胞移植范畴,是侵入性最小的β细胞替代疗法,与胰腺移植相比具有安全、简便、利于体外移植物修饰、不良反应低和可重复性好等优点,短期疗效令人满意,已成为很有发展前景的方法。但是,当前的胰岛移植仍存在供胰需要量大,胰岛移植物代谢活性差,存活率低等问题。因此,胰岛移植的远期疗效仍不乐观。造成这些问题的原因很多。首先,胰岛制备的质量对移植胰岛功能的恢复起到重要影响,在胰岛分离纯化过程中始终要注意保护胰岛的存活和功能。其次,移植后受体自身免疫性疾病复发导致的胰岛死亡,移植物再血管化延迟引起的胰岛持续缺血缺氧,移植物进入体内面临的炎症反应,以及氧化应激反应等,均可引起胰岛移植物的破坏。而且,上述因素不仅可以直接损伤胰岛,还可以活化各种细胞因子,如白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ,以及一氧化氮（NO）等,对胰岛移植物产生严重的损害。近年来的研究表明,IL-1β、TNF-α等细胞因子对胰岛的损害主要通过刺激诱导型一氧化氮合酶（inducible NO synthase,iNOS）过度表达来完成的。在这些细胞因子的作用下,胰岛中的β细胞和巨噬细胞可大量表达iNOS,催化生成过量的NO,后者作为效应分子发挥对胰岛β细胞的损害作用。本实验使用RNA干扰和iNOS抑制剂氨基胍,抑制iNOS的表达与活性,观察胰岛的存活和功能,从而明确iNOS/NO对胰岛的损害作用,探索保护胰岛功能的途径。实验方法一、胰岛的分离和纯化普通级封闭群Wistar大鼠,体重200-250g。采用腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉,胶原酶V原位灌注,快速切取,水浴消化。消化液呈乳糜状、外观不透明时迅速倒入冷的Hank’s液,加满50ml离心管以终止消化,并且轻轻振荡混匀后低温离心一次。再经80目不锈钢筛网过滤,以去除大快的组织和线结,再次离心。然后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛。二、胰岛培养及分组胰岛分离纯化后悬浮于RPMI-1640培养基中培养,培养密度为20IEQ/孔,培养条件为:37℃、5%二氧化碳、95%空气。根据实验目的分为空白对照组、RNA干扰组、氨基胍组、细胞因子组、RNA干扰+细胞因子组、氨基胍+细胞因子组。三、转染使用iNOS的siRNA转染培养的胰岛。分别将转染试剂与siRNA用不含血清和抗菌素的培养基稀释后混合,形成siRNA-转染试剂混合液。将siRNA-转染试剂混合液加入含有胰岛的培养基中,在37℃的CO2培养箱中培养8h后将培养基更换为含有血清和抗菌素的完全培养基,继续培养24、48h。四、RT-PCRRT-PCR检测胰岛组织中iNOS mRNA水平,以反映RNA干扰效果。同时检测凋亡相关基因Bax和Fas的表达,以反映胰岛的凋亡情况。GAPDH作为内参照。五、Western-blotWestern-blot检测iNOS蛋白的表达,检测RNA干扰的效果,β-actin作为内参照。六、检测NO和iNOSNO试剂盒通过硝酸还原酶法检测培养液NO水平,NOS试剂盒检测胰岛组织iNOS活性。七、胰岛活性鉴定胰岛分离纯化培养后,用丫啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色观察胰岛活性。将AO/EB与胰岛制备物混合孵育10min,在荧光显微镜下观察。AO对活细胞染色发出绿色荧光,EB对死细胞染色呈桔黄或桔红色荧光。八、胰岛功能检测胰岛素释放实验,胰岛用Kreb’s-Hank’s液（含有10mmol/L的HEPES和0.25%牛血清白蛋白）液洗涤二次,计数10IEQ胰岛。先用含低浓度葡萄糖（2.8mmol/L）的Kreb’s-Hank’s液孵育2h,然后用含有高浓度葡萄糖（16.7mmol/L葡萄糖）的Kreb’s-Hank’s液孵育1h。收集第2h和第3h的培养液并去除附着的细胞和碎片,采用放免法检测培养液中胰岛素含量,计算胰岛素释放指数（Secretion Index,SI）。SI=第3h（高糖环境）的胰岛素含量/第2h（低糖环境）的胰岛素含量。九、统计学分析使用软件SPSS13.0进行统计学分析,所用数据以平均数±标准差表示,P＜0.05为有统计学差异。实验结果一、胰岛获得量、纯度及活性采用名尼苏达大学改良法,平均每只大鼠可获得约500—600IEQ胰岛,STZ染色提示纯度在80%以上,AO/EB荧光染色显示新鲜分离的胰岛存活率＞95%。二、RNA干扰效果在培养的胰岛中加入细胞因子IL-1β和TNF-α后,iNOS-mRNA表达显著增强,而RNA干扰能够抑制这种细胞因子的刺激作用,使iNOS-mRNA表达减弱,并阻止iNOS蛋白产物的合成。上述结果提示,RNA干扰技术可以成功的沉默大鼠胰岛组织的iNOS基因,抑制iNOS蛋白生成。三、胰岛培养液中NO水平及胰岛组织中iNOS活性新分离纯化的胰岛中iNOS活性较低,培养液中NO含量较少;而用细胞因子IL-1β和TNF-α处理胰岛24h后,iNOS和NO水平均明显升高。而当细胞因子和氨基胍共同加入培养基时,胰岛iNOS活性受到显著抑制,NO水平也明显降低。提示氨基胍可以抑制iNOS活性,效果确切。四、胰岛活性AO/EB染色显示,新分离纯化后的胰岛存活率＞95%;而与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养24h后,胰岛大量死亡。当使用RNA干扰或诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍,与细胞因子共同作用于胰岛时,AO/EB染色显示胰岛存活情况明显改善。五、胰岛凋亡胰岛经细胞因子IL-1β和TNF-α处理后,促凋亡基因Bax和Fas表达明显升高,提示这两种细胞因子能够诱导胰岛细胞凋亡。而经RNA干扰沉默iNOS基因后,胰岛与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养时,促凋亡基因表达明显下降。六、胰岛功能新分离纯化后的胰岛功能较好,基础胰岛素分泌量和胰岛素释放指数较高;而与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养24h后,胰岛分泌量和释放指数明显下降,提示胰岛功能遭到破坏。使用RNA干扰或氨基胍处理后的胰岛,再同细胞因子共同培养时,胰岛素分泌和释放指数均明显高于细胞因子组,胰岛功能得到保护。结论一.在IL-1β、TNF-α等细胞因子的刺激下,胰岛组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）可大量表达,催化合成的高浓度NO是β细胞损伤的效应因子。二.使用RNA干扰技术特异性沉默iNOS基因,从mRNA水平证明iNOS/NO介导了细胞因子对胰岛的损害。三.氨基胍减轻细胞因子对胰岛的损害,改善胰岛的存活与功能,是通过抑制胰岛iNOS活性,控制NO过量产生来实现的。
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标签：胰岛论文; 细胞因子论文; 诱导型一氧化氮合酶论文; 干扰论文; 氨基胍论文;