壳聚糖油酸复合物纳米微球的制备及性能

论文摘要

纳米药物具有能够改善药物的溶解速率,增强药物的靶向性、缓释性、可控性,低毒性及智能性等性质。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性,近年来在药物制剂中的应用越来越广泛,壳聚糖基纳米微粒是一类极具应用前景的药物控释载体。本文建立了一种壳聚糖油酸复合物纳米微球体系,对这种体系进行了特性分析,并对纳米微球的制备工艺进行了进一步探讨。本论文制备了油酰壳聚糖复合物（OCS）,并检测了OCS的物理化学性质。利用OCS制备出纳米微球,分析了该纳米微球对成纤维细胞及血液细胞的细胞毒性、体内分布情况以及透粘膜特性。选用阿霉素和利福平做模型药物,检测了OCS纳米微球对药物的控释情况。在OCS疏水修饰的基础上通过羧甲基化、季铵盐化以及降解得到壳寡糖的办法制备了水溶性的两亲衍生物,并制备出纳米微粒。制备了OCS包被的聚丙酸-乙醇酸（PLGA）纳米微球。利用EDC介导反应及壳聚糖和油酰氯反应的办法合成OCS,红外光谱、紫外光谱及核磁共振谱检测证明了产物的结构。OCS溶解性比壳聚糖差,但是溶解性随pH变化的趋势和壳聚糖一样;随着OCS取代度的增高溶解性降低;随着OCS分子量的增大溶解性降低。所制备的OCS具有降低表面张力的能力;随着取代度的增高和分子量的降低,这种降低表面张力的能力逐渐增强。OCS在溶液中具有较高的粘度,粘度高于壳聚糖,且粘度随着取代度的增大和分子量的增大而增强。OCS在盐酸中的粘度比在乙酸中低;温度增高OCS粘度降低。OCS具有一定的吸湿性,但是吸湿性比壳聚糖差,油酸基的引入打破了壳聚糖分子原来的排列,并且占据了部分氨基的位点,氨基数量的减少使氢键的减少,因此OCS吸湿性比壳聚糖差。通过荧光探针实验、激光球度散射仪、透射电镜观察检测了OCS纳米微球的成球性质。结果表明随着浓度增大,取代度的增大,OCS分子量的降低成球趋势愈加明显。取代度5%、11%、27%的三个样品临界聚集浓度（CAC）值分别是79.43mg/L、31.6mg/L和10mg/L。分子量的增大不利于微球形成,分子量越大,CAC值越大。CH2Cl2的加入有利于OCS溶液中疏水微区的形成。利用乳化均质法处理OCS可以形成纳米微球,所制备的纳米微球呈圆形,形态完整。取代度5%和11%的两个样品所形成的纳米微球的粒径分别是327.4nm和275.3nm;随着OCS取代度增大球粒径降低,因为在高取代度溶液中能形成更紧密地疏水内核。分子量的增大不利于纳米微球的形成,高分子量的样品不能形成纳米微球。红外光谱显示利福平已经成功的负载到OCS纳米微球上。随着取代度的增大微球对利福平包封率和载药量逐渐增高;随着分子量的降低微球对利福平包封率和载药量升高。OCS纳米微球具有一定的缓释效果,取代度的增大和分子量的提高可以增强缓释效果。利福平在pH6.0和pH6.8的释放介质中的释放没有明显差异,在pH3.8的介质中释放要比上面两个条件下慢。TPP的加入可以明显减慢利福平的释放。高利福平浓度的样品释放的比较缓慢,药物平衡释放分数较小。红外结果显示阿霉素已经成功的负载到OCS纳米微球上。阿霉素在三个不同取代度的OCS样品中的释放速率和平衡释放分数相差不大;阿霉素在高分子量的OCS样品中具有较好的缓释效果和较高的平衡释放分数。阿霉素在pH3.8的醋酸缓冲液中比在pH6.8的PBS中具有较高的平衡释放分数。投药量对阿霉素的缓释影响不大。OCS浓度的增大可以降低阿霉素释放速率。交联剂TPP的加入对阿霉素释放影响不大。溶血实验表面直接接触时各个OCS样品对红细胞可被看作是无毒的;然而溶液实验以及纳米微球的结果却显示这些OCS复合物在溶液状态下对红细胞的毒性作用是不容忽视的。大部分OCS样品在作用浓度为0.1%时溶血率均低于10%,符合与血液接触应用以及适用于静脉注射的较宽泛标准。细胞毒性实验显示壳聚糖、OCS及OCS纳米微球对胎鼠皮肤成纤维细胞均未表现出明显的细胞毒性。OCS的细胞毒性略大于壳聚糖,但是所形成的OCS纳米微球对细胞毒性比壳聚糖低。体内分布实验表明纳米微球在心脏和肝脏内基本上没有;肺部分布得较多,在肺部的微球浓度随时间逐渐降低;在血液中的微球浓度随时间降低;肾脏中的微球浓度逐渐增大。透粘膜实验表面OCS和不同取代度的纳米微球对粘膜具有较好的透过性。纳米微球对胃粘膜的吸附性优于OCS溶液;但是对肠粘膜的透过吸附性显著差于溶液。取代度5%的样品对胃粘膜的吸附能力高于2%样品;而对肠粘膜的吸附能力差于2%的样品。通过羧甲基化、季铵盐化和H2O2降解的办法制备水溶性的双亲OCS衍生物。红外结果显示我们已经成功的制备了羧甲基油酰壳聚糖（OCMCS）、油酰壳聚糖季铵盐（OQCS）和油酰壳寡糖（OCSO）。所制备的OCMCS和OQCS相对壳聚糖和OCS具有更好的溶解性,在中性条件下可以溶解;OCSO在中性条件下能够很好的溶胀。三种材料都具有良好的吸湿性和生物相容性。采用O/W乳化法制备了纳米微球,透射电镜结果显示纳米微球形状完整,粒径分析结果显示大小均为200nm左右。用这种方法成功制备出了在中性条件下的纳米微球,拓宽了我们之前制备的OCS纳米微球的应用范围。通过乳化法制备了OCS包被的PLGA纳米微球,并检测了制备过程中各个因素对成球率、微球稳定性和微球形态的影响。随着PLGA加入量增多,纳米微球成球率先增大后减小;提高OCS浓度使成球率降低;成球率随着CH2Cl2加入量的增多而上升;提高均质速率使成球率上升。提高PLGA的量有利于纳米微球核心的形成;加大OCS的浓度有利于纳米微球的形成;加大CH2Cl2的加入量有利于纳米微球的形成。所制备的纳米微球具有较好的形态和稳定性,原子力显微镜和透射电镜结果显示样品纳米微球的粒径200nm左右,微球形态圆形,大小均一。所制备的壳聚糖油酸复合物纳米微球具有较好的形态和稳定性,壳聚糖油酸复合物是一种非常好的可用作载药微球制备的材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0. 前言
• 0.1 纳米医药技术概况
• 0.1.1 纳米载药系统种类
• 0.1.1.1 脂质体
• 0.1.1.2 固体脂质纳米粒
• 0.1.1.3 纳米药物
• 0.1.1.4 聚合物胶束
• 0.1.1.5 磁性纳米粒
• 0.1.2 制备纳米载体的聚合物
• 0.1.2.1 纳米微粒中的合成高分子聚合物
• 0.1.2.2 生物降解天然聚合物
• 0.1.2.2.1 多聚糖天然高分子聚合物
• 0.1.2.2.2 蛋白类高分子化合物
• 0.2 甲壳素与壳聚糖
• 0.2.1 壳聚糖的活性作用
• 0.2.1.1 抗氧化、降脂、降胆固醇和防治动脉粥样硬化
• 0.2.1.2 凝血作用和抗凝血作用
• 0.2.1.3 抗肿瘤活性
• 0.2.1.4 增强免疫力
• 0.2.1.5 抗菌作用
• 0.2.2 壳聚糖医药材料的研究
• 0.2.2.1 药用缓释载体
• 0.2.2.1.1 壳聚糖缓释膜
• 0.2.2.1.2 壳聚糖缓释凝胶
• 0.2.2.1.3 微球
• 0.2.2.1.4 高分子药物
• 0.2.2.2 医用材料
• 0.2.3 壳聚糖水溶性改性
• 0.2.3.1 控制乙酰化/脱乙酰化条件制备水溶性壳聚糖
• 0.2.3.2 利用胺基和羟基上发生的反应制备水溶性壳聚糖衍生物
• 0.2.3.3 水溶性低聚壳聚糖的制备
• 0.3 壳聚糖纳米微粒的研究进展
• 0.3.1 壳聚糖纳米微粒的制备方法
• 0.3.1.1 离子交联法
• 0.3.1.2 共价交联法
• 0.3.1.3 沉淀析出法
• 0.3.1.4 大分子复合法
• 0.3.1.5 乳化溶剂挥发法
• 0.3.1.6 自组装的壳聚糖衍生物纳米微粒
• 0.3.1.7 壳聚糖包被系统
• 0.3.1.8 正负离子模板聚合法
• 0.3.2 壳聚糖纳米粒的生物学效应
• 0.3.2.1 增加药物的吸收作用
• 0.3.2.2 增加药物的靶向性和降低药物副作用
• 0.3.2.3 增强药物的缓释作用
• 0.3.2.4 提高药物稳定性
• 0.3.2.5 抗肿瘤活性
• 0.4 课题的提出
• 1. 油酰壳聚糖（OCS）的制备和表征
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 药品与试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.1.3 方法
• 1.1.3.1 壳聚糖样品的制备
• 1.1.3.1.1 不同分子量壳聚糖的制备
• 1.1.3.1.2 壳聚糖粘均分子量的测定
• 1.1.3.1.3 壳聚糖脱乙酰度的测定
• 1.1.3.1.4 壳聚糖的红外光谱检测
• 1.1.3.2 OCS 的制备
• 1.1.3.3 OCS 的性质检测
• 1.1.3.3.1 FT-IR 检测
• 1.1.3.3.2 紫外光扫描
• 1H NMR检测'>1.1.3.3.3¹H NMR检测
• 1.1.3.3.4 溶解性检测
• 1.1.3.3.5 吸湿性测定
• 1.1.3.3.6 粘度测定
• 1.1.3.3.7 表面张力测定
• 1.2 结果和讨论
• 1.2.1 壳聚糖样品的特性检测
• 1.2.1.1 壳聚糖粘均分子量的测定
• 1.2.1.2 壳聚糖脱乙酰度的测定
• 1.2.1.3 壳聚糖的红外光谱
• 1.2.2 OCS 的制备
• 1.2.3 OCS 性质的测定
• 1.2.3.1 红外光谱检测
• 1.2.3.1.1 壳聚糖和不同取代度 OCS 红外光谱
• 1.2.3.1.2 不同分子量 OCS 红外光谱
• 1.2.3.2 核磁光谱测定
• 1.2.3.3 紫外光谱扫描
• 1.2.3.4 取代度测定
• 1.2.3.5 溶解度检测
• 1.2.3.5.1 不同取代度 OCS 溶解性
• 1.2.3.5.2 不同取代度 OCS 溶解性随pH 变化
• 1.2.3.5.3 不同分子量 OCS 溶解性随pH 的变化
• 1.2.3.6 粘度测定
• 1.2.3.6.1 几种不同取代度 OCS 的粘度
• 1.2.3.6.2 不同分子量 OCS 的粘度
• 1.2.3.6.3 pH 对粘度的影响
• 1.2.3.6.4 温度对粘度的影响
• 1.2.3.7 表面张力的测定
• 1.2.3.7.1 不同取代度 OCS 表面张力
• 1.2.3.7.2 不同分子量 OCS 表面张力
• 1.2.3.8 吸湿性测定
• 1.2.3.8.1 在饱和硫酸铵中的吸湿性
• 1.2.3.8.2 在饱和氯化钙中的吸湿性
• 1.2.3.8.3 在饱和碳酸钠中的吸湿性
• 1.3 小结
• 2. OCS 纳米微球的制备及表征
• 引言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 药品与试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 方法
• 2.1.3.1 荧光探针实验
• 2.1.3.2 纳米微球制备
• 2.1.3.3 球径分析
• 2.1.3.4 透射电镜观察
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 荧光光谱
• 2.2.1.1 OCS 荧光光谱
• 2.2.1.1.1 壳聚糖和 OCS
• 2.2.1.1.2 加入有机相CH2C12的影响
• 2.2.1.1.3 不同取代度OCS 荧光光谱
• 2.2.1.1.4 不同分子量的 OCS 的荧光光谱
• 2.2.1.2 其他条件对荧光光谱的影响
• 2.2.1.2.1 温度的影响
• 2.2.1.2.2 加入小分子盐的影响
• 2.2.1.2.3 溶液的极性的影响
• 2.2.1.2.4 pH 的影响
• 2.2.2 微球透射电镜分析
• 2.2.2.1 不同取代度 OCS 纳米微球
• 2.2.2.2 不同分子量 OCS 纳米微球
• 2.2.2.3 加入有机相的影响
• 2.2.3 光散射球度分析仪检测其球径分布
• 2.3 小结
• 3. OCS 纳米微球的药物负载及释放性能
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 药品和试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 方法
• 3.1.3.1 利福平
• 3.1.3.1.1 利福平-OCS 纳米载药微球的制备
• 3.1.3.1.2 载利福平微球的红外光谱分析
• 3.1.3.1.3 包封率和载药量的测定
• 3.1.3.1.3.1 利福平工作曲线的绘制
• 3.1.3.1.3.2 包封率和载药量的测定
• 3.1.3.1.4 利福平-OCS 纳米载药微球体外释放性能
• 3.1.3.2 阿霉素
• 3.1.3.2.1 阿霉素-OCS 纳米载药微球的制备
• 3.1.3.2.2 载阿霉素微球的红外光谱分析
• 3.1.3.2.3 阿霉素工作曲线的绘制
• 3.1.3.2.4 阿霉素的体外释放实验
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 利福平
• 3.2.1.1 利福平工作曲线
• 3.2.1.2 包载利福平后的红外光谱
• 3.2.1.3 利福平-OCS 纳米微球的体外释放
• 3.2.1.3.1 取代度不同的OCS纳米微球
• 3.2.1.3.2 分子量不同的OCS纳米微球
• 3.2.1.3.3 包载利福平后在不同pH 下的释放情况
• 3.2.1.3.4 加入 TPP 的量不同对释放的影响
• 3.2.1.3.5 药物浓度对释放的影响
• 3.2.2 阿霉素
• 3.2.2.1 阿霉素工作曲线
• 3.2.2.2 包载阿霉素后的红外光谱
• 3.2.2.3 阿霉素-OCS 纳米微球的体外释放
• 3.2.2.3.1 不同取代度OCS纳米微球
• 3.2.2.3.2 分子量不同 OCS 纳米微球
• 3.2.2.3.3 pH 对 OCS 纳米微球缓释的影响
• 3.2.2.3.4 初始药物浓度对体外累释放的影响
• 3.2.2.3.5 OCS 浓度对阿霉素体外释放的影响
• 3.2.2.3.6 交联剂对阿霉素释放的影响
• 3.3 小结
• 4. OCS 纳米微球的生物相容性、体内分布及粘膜透过性
• 引言
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 药品和试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 方法
• 4.1.3.1 红细胞溶血实验
• 4.1.3.1.1 材料与血液直接接触实验
• 4.1.3.1.2 溶液及纳米微球溶血实验
• 4.1.3.2 MTT 检验
• 4.1.3.3 纳米微球体内分布实验
• 4.1.3.3.1 FITC标记OCS
• 4.1.3.3.2 FITC-OCS纳米粒子制备
• 4.1.3.3.3 荧光标记的纳米微球体内分布
• 4.1.3.3.4 荧光标记的纳米微球透黏膜实验
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 红细胞溶血实验
• 4.2.2.1 材料与血液直接接触
• 4.2.2.1.1 不同取代度 OCS 与血液直接接触
• 4.2.2.1.2 不同分子量 OCS 与血液直接接触
• 4.2.2.2 OCS 溶液溶血情况
• 4.2.2.2.1 不同取代度 OCS 溶液溶血情况
• 4.2.2.2.2 不同分子量 OCS 溶液溶血情况
• 4.2.2.3 OCS 纳米微球的溶血情况
• 4.2.2.3.1 不同取代度 OCS 纳米微球溶血情况
• 4.2.2.3.2 不同分子量 OCS 纳米微球溶血情况
• 4.2.2 成纤维细胞活力检验
• 4.2.3 体内分布实验
• 4.2.4 透粘膜实验
• 4.2.4.1 胃粘膜
• 4.2.4.2 肠粘膜
• 4.2.4.3 肠粘膜荧光观察
• 4.3 小结
• 5.羧甲基油酰壳聚糖纳米微球的制备
• 引言
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 药品和试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 方法
• 5.1.3.1 羧甲基壳聚糖的制备
• 5.1.3.2 OCMCS的制备
• 5.1.3.3 溶解性检测
• 5.1.3.4 粘度的测定
• 5.1.3.5 吸湿性的测定
• 5.1.3.6 红外光谱检测
• 5.1.3.7 血液相容性检测
• 5.1.3.8 荧光光谱检测
• 5.1.3.9 纳米微球的制备
• 5.1.3.10 电镜检测及粒径分析
• 5.2 结果和讨论
• 5.2.1 产物的理化性质
• 5.2.2 产物溶解性
• 5.2.2.1 壳聚糖和CMCS的溶解性
• 5.2.2.2 不同取代度羧甲基壳聚糖
• 5.2.2.3 不同反应温度下CMCS的溶解性情况
• 5.2.2.4 水含量对羧甲基壳聚糖溶解性的影响
• 5.2.2.5 NaOH 含量对溶解性的影响
• 5.2.2.6 OCMCS 的溶解性
• 5.2.3 产物的红外图谱
• 5.2.4 荧光光谱
• 5.2.4.1 不同取代度CMCS的荧光光谱
• 5.2.4.2 CMCS和OCMCS的荧光
• 5.2.5 血液相容性
• 5.2.6 粘度测定
• 5.2.7 CMCS的吸湿性
• 5.2.8 电镜检测
• 5.2.9 粒径分析
• 5.3 小结
• 6. 油酰壳聚糖季铵盐纳米微球的制备
• 引言
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 药品和试剂
• 6.1.2 仪器
• 6.1.3 方法
• 6.1.3.1 QCS的制备
• 6.1.3.2 OQCS 的制备
• 6.1.3.3 溶解性检测
• 6.1.3.4 红外光谱检测
• 5.1.3.5 荧光光谱检测
• 6.1.3.6 纳米微球的制备及检测
• 6.1.3.7 纳米微球稳定性检测
• 6.2 结果和讨论
• 6.2.1 产物的理化性质
• 6.2.2 溶解性
• 6.2.3 红外光谱
• 6.2.4 荧光光谱
• 6.2.5 电镜检测
• 6.2.6 稳定性检测
• 6.3 小结
• 7. 油酰壳寡糖纳米微球的制备
• 引言
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 药品和试剂
• 7.1.2 仪器
• 7.1.3 方法
• 7.1.3.1 CSO 的制备
• 7.1.3.2 OCSO的制备
• 7.1.3.3 OCSO溶解性的检测
• 7.1.3.4 红外图谱
• 7.1.3.5 荧光光谱
• 7.1.3.6 OCSO纳米微球的制备及检测
• 7.1.3.7 OCSO纳米微球稳定性实验
• 7.2 结果和讨论
• 7.2.1 红外图谱
• 7.2.2 油酰壳寡糖的溶解性
• 7.2.3 紫外光谱
• 7.2.4 荧光光谱
• 7.2.5 电镜检测
• 7.2.6 稳定性
• 7.3 小结
• 8. OCS 包被的 PLGA 纳米微球的制备
• 引言
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 药品与试剂
• 8.1.2 仪器
• 8.1.3 方法
• 8.1.3.1 OCS包被的PLGA 纳米微球制备
• 8.1.3.2 红外光谱检测
• 8.1.3.3 单因素实验设计
• 8.1.3.4 成球率检测
• 8.1.3.5 稳定性实验
• 8.1.3.6 纳米微球形态检测
• 8.2 结果和讨论
• 8.2.1 红外图谱
• 8.2.2 PLGA-OCS 纳米微球成球率
• 8.2.2.1 PLGA 加入量对成球率的影响
• 8.2.2.2 OCS 浓度对纳米微球成球率的影响
• 8.2.2.3 二氯甲烷加入量对成球率的影响
• 8.2.2.4 均质速率对纳米微球成球率的影响
• 8.2.3 制备条件对纳米微球稳定性的影响
• 8.2.3.1 PLGA 加入量对纳米微球稳定性影响
• 8.2.3.2 OCS 浓度对纳米微球稳定性的影响
• 8.2.3.3 二氯甲烷加入量对纳米微球稳定性影响
• 8.2.3.4 均质速率的影响
• 8.2.4 纳米微球形态检测
• 8.3 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文