改性氨基葡萄糖化合物诱导MSCs/iPSCs成软骨细胞的生物学评价

论文摘要

氨基葡萄糖（Glucosamine，GA）是健康关节软骨的天然组织成份，是软骨基质中合成蛋白聚糖必需的重要元素。其酰化衍生物也是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，在生物体内具有许多重要生理功能。利用组织工程学方法对软骨缺损进行修复逐渐成为治疗软骨相关疾病的有效手段。随着GA及其衍生物在软骨组织工程中研究的深入，对GA及其衍生物诱导组织工程种子细胞成软骨细胞的能力及其影响机制的探讨也越来越成为软骨组织工程研究的热点。本研究首先对GA进行改性得到N-丙烯酰氨基葡萄糖（N-acryloyl-glucosamine，AGA），再将其与原料氨基葡萄糖盐酸盐（Glucosaminehydrochloride，GAH）及另一GA衍生物-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-glucosamine，GlcN.Ac）分别同时诱导人间充质干细胞（human Mesenchymal Stem Cells，hMSCs）向软骨细胞分化，并从软骨细胞的增殖和形态、软骨细胞外基质的分泌、软骨特异性基因的表达三个方面比较这三种GA化合物诱导能力的大小，以期对GA及其衍生物诱导hMSCs成软骨细胞的效用做以初步研究和比较。本论文通过用丙烯酰氯对GAH进行化学改性，并调节合成反应原料中丙酮与水的比例得到纯度较高的合成产物AGA（产率为32%），省去了传统合成方法的过柱提纯步骤，优化了AGA的合成工艺条件。用分别添加不同质量的GAH、GlcN.Ac、AGA的诱导培养基诱导hMSCs成软骨细胞，进行生物相容性评价和成软骨细胞能力的鉴定。细胞增殖毒性检测（Water-Soluble Tetrazolium，WST）和Live&dead死活细胞染色结果一致表明hMSCs在三种氨糖培养基中生长粘附良好，均能正常增殖，且hMSCs增殖程度和细胞形态与添加氨糖的不同摩尔浓度有剂量依赖性关系；添加GAH高浓度（≥5mM）时会对hMSCs细胞产生较大毒性，从而导致诱导培养过程中细胞的死亡；添加GlcN.Ac对hMSCs细胞形态影响较大，随着诱导培养时间的增加，hMSCs细胞会向肥大型细胞形态发展；添加AGA不仅能够保证hMSCs细胞的有效增殖，且能保持诱导过程中hMSCs细胞自身长梭型的细胞形态。在成软骨诱导液中培养7天后，对三种氨糖组别分别进行基因表达水平和免疫组织学水平的检测。聚合酶链式反应（Polymerasechain reaction，PCR）和阿利新蓝及Collagen II染色阳性结果表明三种GA化合物均能在一定程度上促进MSCs细胞向软骨细胞的分化和表达，软骨细胞外基质的分泌和软骨特异性基因（Sox9、Collagen II和Aggrecan）的表达与添加氨糖的不同摩尔浓度也存在剂量依赖性关系；其中AGA组三个基因的表达水平都超过其他两组，充分证实AGA诱导hMSCs分化为软骨细胞的有效性；成软骨细胞诱导实验结果还表明添加TGF--β3（Transforming growth factor beta3）组别的hMSCs细胞增值速度较快，细胞形态变化较小，添加的TGF--β3能够促进宿主细胞基质中Collagen II和Aggrecan的表达，有助于软骨细胞的形成，且这种作用在AGA诱导的情况下表现更加明显，说明AGA与TGF-β3协同作用对诱导hMSCs成软骨细胞具有显著的促进作用。多能诱导干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是目前被广泛应用的一类干细胞，它不仅在一定程度上解决了胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）和MSCs在医学上的伦理道德问题，而且克服了二者不同基因背景的缺陷，可作为组织工程的优异种子细胞来源。本研究通过在培养基内添加表皮细胞生长因子（epidermalgrowth factor, EGF），成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, bFGF）和血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factorAB，PDGF AB）三种生长因子诱导hiPSCs得到hMSCs作为种子细胞，并将其直接进行成软骨细胞诱导，通过检测宿主细胞Sox9、Collagen II和Aggrecan基因水平的表达对iPSCs的成软骨细胞能力进行初步研究。结果表明iPSCs细胞成软骨细胞诱导结果与hMSCs细胞成软骨细胞诱导结果相比，具有更高的Collagen II和Aggrecan表达，证实iPSCs细胞有较好的向软骨细胞分化的潜能，为临床找到一种新的软骨组织工程用种子细胞提供了一定的参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语简表
• 第一章 绪论
• 1.1 软骨疾病与软骨组织工程研究现状
• 1.1.1 软骨疾病
• 1.1.2 软骨组织工程研究现状
• 1.2 氨基葡萄糖及其在软骨组织工程领域的应用
• 1.2.1 氨基葡萄糖及其衍生物
• 1.2.2 氨基葡萄糖及其衍生物在软骨组织工程领域的应用
• 1.3 软骨组织工程与种子细胞的选择
• 1.3.1 软骨组织工程
• 1.3.2 软骨组织工程种子细胞的选择
• 1.4 生物材料与细胞相互作用的生物学评价
• 1.4.1 生物材料与细胞的相互作用
• 1.4.2 生物材料与细胞相互作用的生物学评价
• 1.5 转化生长因子及其在软骨组织工程领域的应用
• 1.5.1 转化生长因子
• 1.5.2 转化生长因子及其在软骨组织工程领域的应用
• 1.6 论文的研究目的、意义及主要内容
• 1.6.1 论文研究目的及意义
• 1.6.2 论文研究的主要内容
• 第二章 N-丙烯酰胺基葡萄糖的合成
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 表征仪器
• 2.2.3 反应式
• 2.2.4 实验操作
• 2.2.5 粗产品的过柱提纯
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同溶剂体系对产物纯度的影响
• 2.3.2 不同溶剂体系产物收率
• 2.3.3 AGA 的1H-NMR 结果
• 2.3.4 AGA 的 FTIR 结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 改性氨基葡萄糖化合物诱导 MSCs 成软骨细胞的生物学评价
• 3.1 引言
• 3.2 实验
• 3.2.1 主要材料及设备
• 3.2.2 源细胞
• 3.2.3 实验方案设计
• 3.2.4 细胞增殖毒性检测 WST 实验
• 3.2.5 Live&Dead 死活细胞染色
• 3.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应 Q-PCR 实验
• 3.2.7 免疫组织化学染色
• 3.2.8 糖胺聚糖 GAG/DNA 定量
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同氨糖化合物诱导 MSCs 成软骨细胞的 WST 结果及讨论
• 3.3.1.1 不同氨糖化合物诱导能力的比较
• 3.3.1.2 摩尔浓度对氨糖化合物诱导作用的影响
• 3.3.1.3 TGF-β3 对氨糖化合物诱导作用的影响
• 3.3.2 不同氨糖化合物诱导 MSCs 成软骨细胞的 Live&Dead 染色结果及讨论
• 3.3.2.1 不同氨糖化合物对 MSCs 细胞增殖及细胞形态的影响
• 3.3.2.2 TGF-β3 对氨糖化合物诱导作用的影响
• 3.3.3 不同氨糖化合物诱导 MSCs 成软骨细胞的 Q-PCR 结果及讨论
• 3.3.4 不同氨糖化合物诱导组别的免疫组织化学染色结果及讨论
• 3.3.4.1 不同氨糖化合物诱导 MSCs 成软骨细胞分泌糖胺聚糖和 II 型胶原的影响
• 3.3.4.2 TGF-β3 对氨糖化合物诱导作用的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 iPSCs 诱导成 MSCs 及软骨细胞的生物学评价
• 4.1 引言
• 4.2 实验
• 4.2.1 主要材料及设备
• 4.2.2 源细胞
• 4.2.3 实验方案设计
• 4.2.4 iPSCs-MSCs 的形态
• 4.2.5 iPSCs-MSCs 的传代培养
• 4.2.6 iPSCs-MSCs 的定向软骨分化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 诱导过程中 iPSCs-MSCs 的形态变化
• 4.3.2 诱导 iPSCs-MSCs 细胞的传代培养
• 4.3.4 诱导 iPSCs-MSCs 细胞的定向软骨分化
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附录