转TrxS基因啤酒大麦的分子检测和表达分析

论文摘要

大麦是酿造啤酒的主要原料。随着我国啤酒产量的逐年增加，大麦使用量也成比例增加。从2002年起，我国成为世界啤酒第一生产大国，但国产啤酒大麦的生产和供应相对滞后，主要原因之一在于国内啤酒大麦在数量和质量上都不能满足啤酒工业的要求。目前我国啤酒大麦年需求量为300-350万吨，而国产啤酒大麦只有100多万吨，啤酒工业所需的啤酒大麦70％来自国外进口，我国已成为世界上最大的啤酒大麦进口国。啤酒大麦长期依赖进口，不仅影响啤酒企业健康的发展，而且受制于人。因此，只有发展国内啤酒大麦生产，啤酒工业的发展才能有可靠保证。 应用转基因技术进行大麦品质改良是大麦育种的一个新途径。近年来，国外有关硫氧还蛋白h（Trxh）的研究，为应用转基因技术进行大麦品质改良提供了可能。Trxh通过还原靶蛋白中的二硫键（S-S），在许多反应中起着至关重要的作用，参与细胞的各种代谢活动。研究表明，在种子发芽过程中，Trxh能促进淀粉酶的活性提高，增加贮藏蛋白的水溶性，使种子中的贮藏营养物质更易于水解以促进胚乳中的碳氮代谢。而啤酒大麦品质的评价指标如发芽势、发芽率、麦芽浸出率、糖化力等，与大麦种子淀粉酶和蛋白酶活性关系密切。因此，Trxh活性的高低与啤酒大麦品质之间有一定的相关关系。增加种子中Trxh的活性，有望改善大麦品质。来源于蓝色黑鸭草的TrxS基因，与硫氧还蛋白h基因有显著的同源性，两者的蛋白表达产物有相似的生物活性，具有硫氧还蛋白h的功能。将TrxS基因导入啤酒大麦品种中，有望提高种子中的Trxh活性，为大麦品质改良提供新途径。 本研究对获得的转TrxS基因啤酒大麦材料进行了分子检测、遗传分析和大麦籽粒生理生化特性测定，从分子水平上验证了目的基因已整合在大麦基因组中，并能够稳定遗传；目的基因在转基因啤酒大麦中能够正常转录和表达，并对目的基因的漂移和转基因大麦的品质性状等进行了研究。主要研究结果如下： 1．获得转TrxS基因啤酒大麦新品系 利用PCR、巢式PCR和PCR-Southern杂交等技术对转基因啤酒大麦豫啤1号、晋引6号和国外品种Harrington、Franklin后代植株进行检测，均检测到阳性植株。其中，豫啤1号、Franklin、Harrington的T1代PCR阳性检测率分别为50.6％、61.2％和67.3％；目的基因在不同材料中的遗传行为不同，外源基因在Harrington、晋引6号中是以单拷贝的形式整合在大麦基因组上，并能够稳定地遗传给后代；Franklin和豫啤1号部分株系符合3∶1的比例，但在后代自交过程中，外源基因发生丢失。经PCR跟踪检测与分析，得到纯合的转基因大麦新品系，为进一步进行外源基因的表达与功能研究奠定了基础。 2．初步明确了转TrxS基因在啤酒大麦中的作用机理 实时荧光RT-PCR检测表明目的基因导入大麦后，在RNA水平上能够正常表达；对转

论文目录

• 中文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 大麦生产现状和存在问题
• 1.1 世界大麦生产概况
• 1.2 大麦在农业上的作用
• 1.3 大麦麦芽品质研究
• 1.4 我国大麦生产概况及存在问题
• 2 DNA重组技术在品质改良上的应用
• 2.1 谷物种子贮藏蛋白基因及其应用
• 2.2.改良淀粉品质的基因工程
• 2.3 改良脂肪酸组成的基因工程
• 3 植物遗传转化研究进展
• 3.1 农杆菌介导转化法
• 3.2 基因枪介导法
• 3.3 花粉管通道法
• 3.4 PEG介导法
• 3.5 脂质体法
• 3.6 大麦遗传转化研究进展
• 4 植物硫氧还蛋白研究进展
• 4.1 硫氧还蛋白系统
• 4.2 植物硫氧还蛋白种类
• 4.3 硫氧还蛋白结构
• 4.4 硫氧还蛋白还原酶
• 4.5 硫氧还蛋白靶蛋白
• 4.6 硫氧还蛋白的功能
• 5 本研究的目的意义和技术路线
• 第二章 转TrxS基因啤酒大麦后代分子检测及遗传分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 大麦基因组DNA的提取
• 1.2.2 PCR检测
• 1.2.2.1 引物的设计
• 1.2.2.2 PCR反应体系和扩增程序
• 1.2.2.3 PCR产物的电泳分析
• 1.2.3 PCR-Southern杂交检测
• 1.2.3.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.3.2 杂交转膜
• 1.2.3.3 探针制备
• 1.2.3.4 PCR-Southern杂交
• 1.3 遗传分析方法
• 2 结果分析
• 2.1 转基因Harrington的分子检测和遗传分析
• 1代PCR检测和遗传分析'>2.1.1 T₁代PCR检测和遗传分析
• 1代巢式PCR检测与PCR-Southern杂交'>2.1.2 T₁代巢式PCR检测与PCR-Southern杂交
• 2代PCR检测和遗传分析'>2.1.3 T₂代PCR检测和遗传分析
• 2.2 转基因豫啤1号分子检测和遗传分析
• 1代PCR检测和遗传分析'>2.2.1 T₁代PCR检测和遗传分析
• 2代PCR检测和遗传分析'>2.2.2 T₂代PCR检测和遗传分析
• 2.3 转基因Franklin分子检测和遗传分析
• 1代PCR检测和遗传分析'>2.3.1 T₁代PCR检测和遗传分析
• 2代PCR检测和遗传分析'>2.3.2 T₂代PCR检测和遗传分析
• 6）转基因后代的分子检测'>2.4 晋引6号（JY₆）转基因后代的分子检测
• 3 讨论
• 第二章 TrxS基因在啤酒大麦中的表达与作用研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 实时荧光RT-PCR检测
• 1.2.1.1 RNA的提取
• 1.2.1.2 cDNA合成
• 1.2.1.3 实时荧光RT-PCR检测
• 1.2.2 Trxh活性测定
• 1.2.3 大麦种子淀粉酶活性、淀粉含量和α-淀粉酶抑制蛋白活性测定
• 1.2.3.1 淀粉酶活性和淀粉含量测定
• 1.2.3.2 大麦α-淀粉酶抑制蛋白对α-淀粉酶活性影响
• 1.2.4 蛋白酶活性和贮藏蛋白组分测定
• 1.2.5 种子吸水速率和发芽势测定
• 2 结果分析
• 2.1 TrxS基因导入大麦后表达分析
• 2.2 转TrxS基因大麦种子Trxh活性变化
• 2.3 转TrxS基因大麦种子淀粉酶、淀粉含量和α-淀粉酶抑制蛋白活性分析
• 2.3.1 转TrxS基因大麦种子淀粉酶活性变化
• 2.3.2 转TrxS基因大麦种子淀粉含量
• 2.3.3 转TrxS基因大麦种子α-淀粉酶抑制蛋白对α-淀粉酶活性的影响
• 2.4 转TrxS基因大麦种子蛋白酶活性和贮藏蛋白含量变化
• 2.4.1 转TrxS基因大麦种子蛋白酶活性变化
• 2.4.2 转TrxS基因大麦种子贮藏蛋白含量变化
• 2.5 转TrxS基因大麦种子吸水速率和发芽势变化
• 3 讨论
• 第四章 啤酒大麦转TrxS基因品质分析及安全性评价
• 1 材料和方法
• 1.1 转TrxS基因啤酒大麦农艺性状分析
• 1.2 转TrxS基因大麦麦芽品质分析
• 1.3 TrxS基因漂移研究
• 1.4 大麦优异种质创育
• 2 结果分析
• 2.1 转TrxS基因大麦农艺性状研究
• 2.2 转TrxS基因大麦麦芽品质性状分析
• 2.3 TrxS基因漂移研究
• 2.4 大麦优异种质的创育
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 在读期间发表文章
• 致谢