论文摘要
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是将双链RNA（double strand RNA，dsRNA）导入细胞内引起同源mRNA降解的一种细胞反应过程。DsRNA进入细胞后被特异性dsRNA核酸酶（Dicer）切割成多个21-25bp的短干扰RNA（short interfering RNAs，siRNAs），siRNAs与一些核酸酶结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），由RISC介导同源mRNA的降解，属于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）的一种。RNAi的应用研究主要是利用体外合成siRNA和体内生成siRNA方法实施的，siRNA能明显抑制目的基因的表达，而且特异性强，目前RNAi技术在抗病毒、抗肿瘤等实验研究中被广泛应用。组织蛋白酶B（cathepsin B，CB）是细胞溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶，能够直接降解或激活纤溶酶原激活剂及基质金属蛋白酶等而间接降解细胞外基质成分，从而参与肿瘤的侵袭转移过程。研究表明，胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤和甲状腺癌等多种恶性肿瘤组织中CB高表达且CB活性高于邻近正常组织。有学者认为，CB有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和辅助诊断的指标。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其浸润转移是导致患者死亡的主要原因。有关CB表达与食管癌发生发展及浸润转移的关系研究少见文献报道；有关采用RNAi技术抑制与食管癌浸润转移相关基因表达的研究尚未见文献报道。本研究应用RNAi技术对食管癌EC9706细胞系CB基因进行抑制，检测抑制后EC9706细胞中CB基因表达情况及侵袭力变化，为今后应用RNAi技术对食管癌等恶性肿瘤进行基因治疗提供实验依据。材料和方法1．食管癌EC9706细胞的培养：食管癌EC9706细胞以含10％胎牛血清的培养液在37℃、5％CO2条件下贴壁培养。2．siRNA的体外合成和鉴定：首先合成DNA模板，5’端为T7启动子序列，可在体外和T7RNA聚合酶结合转录出目的siRNA（21nt）。分别合成一段特异性siRNA和一段无关对照siRNA。应用4％琼脂糖凝胶电泳，测定siRNA的长度和浓度。3．转染：应用LipofectamineTM2000 siRNA Transfection Reagent将siRNA转染细胞。设24h、48h、72h三个转染时间段，每个时间段均设100、150、200pmol三个转染剂量及正常、空白、无关三个对照。4．转染后检测：应用完整细胞原位杂交、免疫细胞化学方法检测细胞内靶基因的表达情况，应用Boyden chamber体外侵袭实验检测细胞体外侵袭力的变化。5．统计方法：应用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，资料以均数±标准差（（?）±S）表示，多样本均数比较采用方差分析。α=0.05为显著性标准。结果1．成功体外合成两段siRNA，长度为21bp。2．原位杂交结果：特异siRNA转染24h、48h、72h，CBmRNA表达量均较对照有所降低，以转染72h的抑制效应最为明显，三者两两相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）；每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强，三者两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常对照、空白对照、无关对照均未表现出对CB mRNA表达的抑制效应，实验组与3者两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3．免疫细胞化学结果：特异siRNA转染24h、48h、72h，CB蛋白表达量均较对照有所降低，以转染72h的抑制效应最为明显，三者两两相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）；每个时间段内随剂量增加siRNA抑制效应均增强，三者两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常对照、空白对照、无关对照均未表现出对CB蛋白表达的抑制效应，实验组与3者两两相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。4．Boyden chamber体外侵袭实验结果：与正常对照、无关对照相比，转染特异siRNA的细胞穿越Matrigel的细胞数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1．应用体外转录系统成功合成siRNA。2．CB特异性siRNA可抑制食管癌EC9706细胞中CB蛋白及mRNA表达，表明RNAi可通过抑制CB表达，进而抑制食管癌浸润转移。3．Boyden chamber体外侵袭实验结果表明，RNAi技术可通过抑制与肿瘤浸润相关基因表达，从而抑制肿瘤细胞侵袭能力。