我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究

论文摘要

本研究用PCR方法对马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株（Agen-EIAV）感染马外周血白细胞的前病毒DNA进行了分段扩增,克隆和序列测定,并参考Genbank已经发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列,应用基因分析软件拼接出Agen-EIAV全基因核苷酸序列。经分析Agen-EIAV株前病毒基因组全长为8227bp,与我国马传贫辽宁强毒株（LN）、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）及美国代表毒株（AF028232）核苷酸序列比较,同源率分别为65%、65%和75%。与AF028232株gag、pol和env、gp90和gp45基因核苷酸同源率分别为99%、99%、75.6%、69.4%和80.4%;而与我国DLV的同源率分别为79.7%,82.3%,72.8%,65.2%和78.6%。Agen-EIAV株gag和gp90推导氨基酸序列与美国4个毒株的氨基酸序列高度同源,而与我国4个毒株却存在很大的差异。 本研究对接种Agen-EIAV的试验马（16#）出现的四个发热期（23d、40d、51d和70d）的外周血单核细胞前病毒DNAgag和gp90的核苷酸序列进行了监测,结果发现四个发热期中前病毒gag核苷酸序列变化不明显,变异率在1%之内。gp90核苷酸序列变化较大,变异率在8～10%之间,可划分出A1、A2、A3和A4四个高变区。其中A1、A3和A4在马体发病的整个过程中均发生一次变异,而A2区在第三个发热期发生变异后,在第四个发热期又回复了突变。结果表明,gag在马传染性贫血病毒与宿主细胞基因组整合之后非常稳定,可以选择此区域设计鉴别诊断的引物。从gp90推导的氨基酸序列可划分为5个可变区,都与N-连接的糖基化位点有关系,进一步证明马传贫病毒囊膜糖基化位点的变化与毒力相关。 本研究在对马传染性贫血病毒美洲等流行毒株和我国弱毒疫苗株全基因序列比较分析的基础上,共设计了11条引物,用于在病毒接种驴白细胞培养物上进行PCR鉴别诊断引物的筛选,通过试验筛选确定选用在gag区设计的6条引物。通过对2匹健康马（2#和31#）,9匹分别接种我国DLV（1#、9#和10#）、Agen-EIAV（16#、45#和46#）和美国代表毒株（Wyoming-EIAV）（3#、4#和44#）试验马的检测及PCR反应条件的进一步优化,而确定鉴别马传贫病毒美洲流行毒株和我国弱毒疫苗株的套式多重PCR方法。试验结果表明当用引物C1/C2n/C3n进行第二轮PCR扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出与设计相符的两个片段,分别为675bp和400bp,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞只能扩增一条675bp的片段;当用引物C1/AF2n/C3n进行扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出一条675bp的片段,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞却能扩增出两个片段,分别为675bp和400bp。而健康马外周血白细胞扩增不任何条带。本试验同时对3匹疫苗免疫马、2匹美洲流行毒株慢性传贫马（45#和46#）和4匹急性传贫马（16#、3#、4#和44#）进行了长时间的跟踪检测,分别可在接毒后最早第7-30天从外周血中检出病毒,至接种后12个月大都可以检出。结果表明本试验建立的PCR鉴别诊断方法具有很好的稳定性和可重复性。本试验还用real-time PCR的方法检验本试验建立的PCR鉴别诊断方法的敏感性,结果表明套式多重PCR可以检出我国DLV免疫马最低病

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 EIAV的概述
• 1.2 EIAV主要基因的变异研究进展
• 1.3 EIAV非结构蛋白的研究概况
• 1.4 本试验的目的和意义
• 第二章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒全基因序列测定与分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株
• 2.1.2 试验动物
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 质粒的小量提取
• 2.2 方法
• 2.2.1 试验动物的接种
• 2.2.2 马外周血单核细胞的制备
• 2.2.3 前病毒DNA的提取
• 2.2.4 前病毒全基因的分段扩增
• 2.2.5 前病毒各基因片段PCR产物的克隆与测序
• 2.3 结果
• 2.3.1 前病毒全基因的分段扩增
• 2.3.2 各段基因的克隆与鉴定
• 2.3.3 Agen-EIAV株各基因片段的序列测定及全基因序列的拼接
• 2.3.4 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232株各基因核苷酸序列比较
• 2.3.5 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gag核苷酸及其编码蛋白的比较
• 2.3.6 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gp90核苷酸及其编码蛋白的比较
• 2.4 讨论
• 第三章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90在马体内的变异分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒株
• 3.1.2 试验动物
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 四个发热期马外周血的采集、PBMC的制备及 DNA的提取
• 3.2.2 四个发热期gag和gp90核苷酸序列的扩增
• 3.2.3 四个发热期gag和gp90PCR产物的克隆与测序
• 3.3 结果
• 3.3.1 四个发热期gag和gp90的PCR扩增
• 3.3.2 四个发热期gag和gp90的克隆与鉴定
• 3.3.3 四个发热期gag和gp90不同克隆的序列测定
• 3.3.4 四个发热期gag核苷酸序列比较
• 3.3.5 四个发热期gp90核苷酸序列及氨基酸比较
• 3.4 讨论
• 第四章 我国马传染性贫血病弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒株
• 4.1.2 试验动物
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 病毒培养
• 4.2.2 马外周血单核细胞的制备
• 4.2.3 引物的设计与合成
• 4.2.4 模板的制备
• 4.2.5 β-actin克隆及序列测定
• 4.2.6 每个 DNA样本质量的检测
• 4.2.7 病毒培养物 PCR检测条件的摸索
• 4.2.8 套式多重 PCR鉴别诊断方法的建立
• 4.2.9 试验动物样品的检测
• 4.2.10 扩增目的条带的克隆及序列测定
• 4.2.11 敏感性试验
• 4.2.12 稳定性和重复性试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 β-actin基因的扩增
• 4.3.2 β-actin基因克隆的序列测定
• 4.3.3 病毒接种细胞培养物套式多重PCR鉴别诊断方法的初步建立
• 4.3.4 扩增目的条带的克隆及序列测定
• 4.3.5 试验动物 PCR检测条件的优化及样本的检测
• 4.3.6 PCR检测的敏感性试验
• 4.3.7 稳定性和重复性试验
• 4.3.8 动物试验PCR检测结果
• 4.3.9 动物试验 PCR检测与琼脂扩散试验检测结果的比较
• 4.4 讨论
• 第五章 马传染性贫血病标记疫苗的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 细胞
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 引物
• 5.1.4 质粒的小量提取
• 5.2 方法
• 5.2.1 驴胎皮肤细胞的制备、培养
• 5.2.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建
• 5.2.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定
• 5.2.4 质粒的提取和纯化
• 5.2.5 质粒在细胞培养中的转染和传代
• 5.2.6 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定
• 5.2.7 嵌合病毒复制动力学分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建及鉴定
• 5.3.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定
• 5.3.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的转染
• 5.3.4 衍生病毒在 FDD细胞培养的生物学特性研究
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历