大豆球蛋白和β-伴球蛋白对小鼠肠上皮细胞营养生理功能的影响与分子机理研究

论文摘要

本研究以自备分离纯化大豆抗原蛋白作实验材料,采用小鼠肠上皮细胞原代培养技术,实验研究了纯化大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对小鼠肠上皮细胞生理功能及生化参数的影响,并在细胞分子水平探索了抗原蛋白对吸收（转运）相关基因表达的影响。1.大豆球蛋白和β—伴球蛋白分离制备。根据大豆7S和11S球蛋白在pH6.1-6.6之间溶解度不同的特点,先对脱脂大豆中两种球蛋白进行初步分离,然后利用硫酸铵进行盐析和凝胶过滤,除去非抗原蛋白组分,得到纯度相对较高的大豆球蛋白和p一伴球蛋白。实验制备结果表明：脱脂大豆（豆粕）在0.03mMTris-HCl、料液比1：20、PH8.0的室温条件下提取2h,豆粕总蛋白提取率为32.88%,能得到蛋白质含量为71.5%的11S粗组分和蛋白质含量60.7%的7S粗组分。粗提取产物经盐析和凝胶过滤,可得到蛋白含量84.2%的纯化大豆球蛋白,和蛋白含量79.5%的纯化β—伴球蛋白。2.自备大豆球蛋白和β—伴球蛋白的细胞培养实验。利用细胞培养技术,设计三个实验研究了不同水平纯化大豆球蛋白、β-伴球蛋白（0、1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml）对体外培养原代小鼠肠上皮细胞完整性、细胞生物学功能及对基因表达的影响。实验结果表明：大豆球蛋白、β—伴球蛋白显著降低体外培养的小鼠肠上皮细胞数量,极显著影响细胞MTT OD值（P<0.01）。细胞培养过程提高大豆球蛋白、β—伴球蛋白含量,显著增加培养液中乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、细胞Na+-K+-ATP酶活性及一氧化氮、IL-2、IL-6、IL-8含量（P<0.05）,显著降低细胞蛋白含量、蛋白沉积量、细胞谷草转氨酶活性（P<0.05）。大豆球蛋白、β—伴球蛋白不影响培养液中NH3含量（P>0.05）。细胞分子水平的实验结果表明,β—伴球蛋白、大豆球蛋白均降低PEPT1和DMT1基因的表达量。β—伴球蛋白显著降低PEPT1基因表达（P<0.05）,高剂量β—伴球蛋白的影响更显著。β—伴球蛋白对DMT1的基因表达的影响明显大于大豆球蛋白的影响。本论文实验研究表明,豆粕抗原蛋白显著影响细胞营养生理功能。β—伴球蛋白的作用明显大于大豆球蛋白。β—伴球蛋白抑制消化道上皮细胞与主要营养物质（蛋白质）吸收相关基因（PEPT1）表达的作用强于抑制无机离子转运相关基因（DMT1）表达的作用。大豆抗原蛋白造成的细胞分子水平的实质变化是引起肠上皮细胞生理功能完整性变化、细胞生理生化参数显著变化、造成细胞增殖能力降低,引起肠道炎性细胞因子（IL-2、IL-6、IL-8）水平显著变化的主要原因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 本文缩写符号说明
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1. 大豆抗原蛋白的结构分类和理化特性
• 2 大豆主要抗原蛋白的实验室分离测定方法
• 2.1 冷沉淀法
• 2.2 等电点沉淀法
• 2.3 盐析法
• 2.4 离子沉淀分离法
• 2.5 免疫法
• 2.6 其他分离方法
• 3 大豆球蛋白、B-伴大豆球蛋白对动物肠道细胞作用机理研究进展
• 3.1 对动物肠道细胞数量形态的影响
• 3.2 对动物肠细胞营养代谢的影响
• 3.3 抗原蛋白对动物可能的致敏机理
• 4. 存在的问题
• 第二部分 本研究的目的、内容意义
• 1 研究目的
• 2 研究内容
• 3 研究意义
• 第三部分 试验研究
• 试验一 大豆球蛋白、B-伴大豆球蛋白的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验样品
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 11S和7S球蛋白的提取分离
• 1.5 11S和7S球蛋白的纯化
• 1.6 样品中蛋白质含量的测定
• 1.7 大豆球蛋白和B-伴大豆球蛋白的鉴定
• 2 试验结果
• 2.1 分级纯化总蛋白含量
• 2.2 粗11S组分和7S组分凝胶过滤图
• 2.3 SDS-PAGE电泳
• 3 讨论
• 4. 小结
• 试验二 大豆球蛋白、B—伴球蛋白对体外培养小鼠肠上皮细胞完整性和功能的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要试液的配制
• 1.5 试验方法
• 1.5.1 细胞的原代分离
• 1.5.2 细胞的培养
• 1.5.3 实验设计
• 1.6 考察指标
• 1.6.1 细胞的观察
• 1.6.2 细胞培养液指标测定
• 1.6.3 细胞内容物指标测定
• 1.6.4 细胞存活率测定
• 1.7 数据处理和统计分析
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 3.1. 大豆抗原蛋白对小鼠肠上皮细胞的完整性的影响
• 3.2. 大豆抗原蛋白抑制小鼠肠上皮细胞增殖
• 3.3. 大豆抗原蛋白降低小鼠肠上皮细胞的蛋白质沉积
• 3.4. 大豆抗原蛋白影响小鼠肠上皮细胞的功能
• 4. 小结
• 试验三 大豆球蛋白、β—伴球蛋白对体外培养小鼠肠上皮细胞营养物质吸收相关基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 引物的设计与合成
• 1.4.2 小鼠肠上皮细胞的制备与样品的处理
• 1.4.3 总RNA的提取
• 1.4.4 逆转录
• 1.4.5 PEPT1、DMT1基因SYBR Green Ⅱ实时荧光定量PCR方法的建立
• 1.5 统计分析
• 2 试验结果
• 3 讨论
• 4.小结
• 试验四大豆球蛋白、β—伴球蛋白对体外培养小鼠肠上皮细胞免疫功能的影响
• 1 材料与方法
• 2 试验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第四部分 全文总体讨论与结论
• 1 总体讨论
• 2 总体结论
• 3. 本研究的创新点
• 4. 有待进一步研究的问题
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录