论文摘要
背景与目的肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,每年约有100万以上的人新患此病,是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一[2]。它也是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之一。进人90年代以来,HCC已成为我国第二位癌症杀手。HCC根治切除术后5年复发率为61.5%,小肝癌的复发率仍高达43.5%,足以见其复发率之高。因此探索HCC术后复发和转移倾向,对HCC的病程进展、复发转移潜能、预后估计等方面有重要的价值。近年来,研究发现核基质结合区结合蛋白质1 （special AT rich sequence binding protein, SATB1）与肿瘤的发生、转移及预后等有一定的关系。本研究采用实时荧光定量PCR、免疫组化和Western Blotting方法,以HCC患者手术切除的癌组织和癌旁组织为研究对象,旨在检测人肝细胞肝癌组织中SATB1 mRNA和蛋白的表达情况,分析SATB1基因表达与HCC的复发转移、临床病理参数及其术后生存时间的关系,从而进一步从分子生物学角度提高对HCC的认识,为HCC的临床诊断、治疗方案和评估预后提供新的线索。材料和方法1、组织标本所有组织标本均取自南方医科大学南方医院肝胆外科2008年9月-2010年10月接受手术治疗的102例HCC患者,收取标本均符合以下条件：①所有病例均经病理确诊；②均具有完整的临床资料、病理资料及随访资料。另取8名非肝癌患者（其中局灶性结节性增生2例,海绵状血管瘤2例,肝细胞腺瘤1例,肝囊肿1例,胆管性错构瘤1例,肝内胆管结石1例；均经病理证实）作为对照。从每例肝癌患者切除组织中取癌组织及癌旁组织各一份,非癌患者取正常肝组织一份,标本分两部分,一部分经RNA保存液处理后-80℃保存备用,另外一部分用来提取组织蛋白。2、RT-PCR及实时荧光定量PCR检测肝细胞肝癌SATB1 mRNA的表达2.1引物设计合成GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS区设计特异性引物。设计引物所用软件名称：Primer Premier 5.0软件。序列如下：Sequence Name:SATB1（扩增片段长度256bp）Forward Primer:5’-AGG AAA ACC GAC AGA AGA C-3’（SATB1-F） Reverse Primer:5’-ACT GAA CCT GAC CGT ACA CCC ACG TCT TGT ATG A AA CT-3’（SATB1-Zr）以GADPH为内参,引物序列如下：Sequence Name:GADPH（扩增片段长度451bp）Forward Primer:5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’（GADPH-F） Reverse Primer:5’-TGG GAA GAC GCC AGT GGA-3 （GADPH-Zr）2.2 RT-PCR及实时荧光定量PCR提取肝癌组织及癌旁组织总RNA后,行逆转录反应（反应体系：20μL；反应条件：65℃5min,42℃60min,70℃5min）,PCR反应（反应体系：50μL；反应条件：95℃5min；95℃30s,62℃30s,72℃60s共35个循环）,实时荧光定量PCR反应（反应体系：40μL；反应条件：95℃30s；95℃5s；60℃34s,40个循环）。2.3计算SATB1 mRNA表达值相对于GAPDH表达值的相对倍数定量PCR结束后系统自动生成CT （threshold cycle number）值,代表每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。为保证实验数据的可靠性,每个样本重复进行三次实验,计算各样本平均CT值和ΔCT值（ΔCT=Ct SATB1-Ct GAPDH）,计算2-ΔΔCt（Ct=Ct目的样本-Ct参照样本）,其数值表示目的表达值相对于参照表达值的相对倍数,即为SATB1 mRNA表达值相对于GAPDH表达值的相对倍数。3、免疫组化检测肝细胞肝癌中SATB1蛋白的表达采用免疫组化二步法测肝细胞肝癌组织及其对应癌旁组织中SATBI蛋白水平的表达。4、Western blotting检测肝细胞肝癌SATB1蛋白的表达4.1 Western blotting实验测定肝癌组织及其癌旁组织SATB1的表达组织裂解法提取组织蛋白,BCA法测定蛋白浓度,行Western blotting实验,结果用紫外线投射凝胶图像扫描仪进行图像分析,Labworks软件测定各条带的OD值。4.2计算肝癌组织中SATB1蛋白相对癌旁表达的倍数Labworks软件测定目的SATB1的光密度值（OD值）及内参GADPH的光密度值（od值）,以（Od×S）/（od×s）（S和s分别代表目的条带和内参条带的面积）代表SATB1蛋白的相对表达量。计算每例标本中癌组织与癌旁组织SATB1蛋白相对表达量的比值（SATB1癌组织/SATB1癌旁组织）,代表肝癌组织中SATBl蛋白相对癌旁表达的倍数,计算公式为：SATB1癌组织/SATB1癌旁组织=[（Od癌×S）/（od癌×s）]/[（Od癌旁×S）/（od癌旁×s）]。5、肝细胞肝癌中SATB1的表达与临床资料的比较结合临床资料,分析肝细胞肝癌中SATB1 mRNA及其蛋白的表达与患者临床病理资料、预后资料的关系。6、统计分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料以X±SD表示。实时荧光定量PCR结果的比较中,癌组织与癌旁组织间的比较采用配对t检验,SATB1 mRNA的表达与临床病理参数之间的比较采用两样本t检验、方差分析、LSD-t检验,SATB1 mRNA表达与HCC患者术后复发转移情况的比较采用X2检验,生存曲线采用Log-Rank检验；免疫组化结果的比较中,统计组间差别采用X2检验及四格表精确概率法,相关性检验用Spearman相关分析。Western blotting结果的比较中,肝癌组织与癌旁组织SATB1蛋白表达高低的比较采用配对t检验,SATB1蛋白的表达与临床病理参数之间的比较采用t检验、One-Way ANOVA,癌组织SATB1蛋白的表达较癌旁组织升高与否的率与临床病理参数之间的比较采用X2检验。选取检验水准α=0.05。结果1、RT-PCR扩增条带显示肝癌组织和部分癌旁组织都存在SATB1的表达,但癌组织的表达高于癌旁组织。2、实时荧光定量PCR检测结果示癌组织SATB1 mRNA表达量显著高于癌旁组织,癌组织中SATB1 mRNA的表达是癌旁组织的3.27倍,P<0.001差异有统计学意义。3、实时荧光定量PCR结果与HCC患者临床病理资料的分析发现癌组织中SATB1 mRNA表达的高低与AFP、肿瘤大小、癌栓、病理分化、TNM分级、术后复发转移有关系,有统计学差异（P<0.05）；与性别、年龄、乙型肝炎表面抗原、肿瘤的数目、肝硬化、包膜无关,无统计学差异（P>0.05）。4、SATB1 mRNA显著高表达组、高表达组、低表达组术后6个月内,6-12月内,12-24月内复发百分率分别是82.61%、0、0；0、26.32%、0；0、47.36%、0。SATB1 mRNA表达与HCC患者术后复发转移存在显著性差异（X2：149.94,P<0.05）5、本组102例病例中,随访时间为1-25个月,中位随访时间12.5月,随访率为100%,其1年累积生存率为68.63%,2年累积生存率为58.82%。进行单因素的预后分析,发现SATB1 mRNA显著高表达组、高表达组、低表达组三组的1年累积生存率分别为0,52.63%和100%,2年累计生存率分别为0,0和100%,生存曲线经Log-Rank检验发现,P<0.01,有统计学意义。6、免疫组化结果显示癌组织和癌旁组织SATB1的表达（阳性率）的差异有统计学意义（X2=31.746,P<0.001）,癌组织的阳性率（75%）显著高于癌旁组织（12.5%）。7、免疫组化结果与HCC患者临床病理资料的分析发现癌组织中SATB1蛋白表达的阳性率与AFP、肿瘤大小、癌栓、病理分化、TNM分级、术后复发转移有关系,有统计学差异（P<0.05）；与性别、年龄、乙型肝炎表面抗原、肿瘤的数目、肝硬化、包膜无关,无统计学差异（P>0.05）8、Western blotting结果显示癌组织和部分癌旁组织都存在SATB1的表达,但癌组织的表达高于癌旁组织；8例正常对照组SATB1蛋白表达阴性。9、Western blotting结果与HCC患者临床病理资料的分析发现肝癌组织和癌旁组织SATB1蛋白相对表达量的比值与AFP、肿瘤大小、癌栓、病理分化、TNM分级、术后复发转移有关系,差异有统计学意义（P<0.05）。与患者的性别、年龄、乙型肝炎表面抗原、肿瘤的数目、肝硬化、包膜是否完整无关,无统计学差异（p>0.05）。结论1、SATB1 mRNA和SATB1蛋白在肝细胞肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织。2、肝细胞肝癌患者癌组织中SATB1 mRNA和SATB1蛋白表达的高低与肝癌的恶性程度（AFP、肿瘤大小、癌栓、病理分化、TNM分级、术后复发转移）有关,恶性程度越高,其SATB1的表达越高。3、SATB1的表达与肝癌的复发转移有关,SATB1 mRNA表达越高,术后发生复发转移的可能性越大,患者术后生存时间越短,SATB1有望成为肝癌复发与转移的一个新的预后指标。4、SATB1的表达可能与HCC的进展有关。