超表达cyp71av1和cpr基因对黄花蒿青蒿素生物合成的影响

论文摘要

多姿多彩的植物不仅能带给人类视觉上的享受,而且能为人类提供许多具有经济价值的产品,例如：植物次生代谢产物可以作为美食被人们享用,可以作为工业生产的原材料,更重要的是还可以作为治病救人的良药。基于以上原因,植物次生代谢产物,特别是天然药用植物次生代谢产物引起了国内外研究者的广泛关注,包括其生物合成途径,催化各步反应的酶和基因,通过微生物生产的方法和化学方法人工合成或半合成各种植物次生代谢产物以及其前体物质和功能类似物等。植物次生代谢产物（plant Secondary metabolites）是区别于植物初生代谢产物（plant primary metabol ites）,（?）]：糖类、脂类和蛋白类,不为植物生长发育所必须,往往是植物与环境相互作用,在生命周期后期阶段产生的小分子有机化合物。疟疾（malaria）是一类由于蚊虫叮咬传染疟原虫（Plasmodium falciparum）的疾病,在热带和亚热带地区发病率较高,非洲的疟疾流行性表现最为严重。疟疾临床症状主要表现为打颤,发高烧和流汗等。这种疾病流行性强,危害人类健康,给人类社会带来巨大的经济和精神损失,影响社会的快速发展。随着世界经济全球化进程的加速,特别是中国综合国力显著增强,中非两国交往频繁性提高,输入性疟疾对中国人民身体健康的威胁在变大。青蒿素是目前通过世界卫生组织认证的唯一有效的治疗疟疾的药,特别是对脑型疟疾有极好的疗效。在野生黄花蒿中,由于受遗传和生长环境等因素的影响,青蒿素含量很低（0.01-0.6%,干重）,无法满足市场需求。虽然可以通过化学方法合成青蒿素的前体物质或者直接合成青蒿素,但是有副产物生成,成本过高,具有毒性,对环境会造成不良影响。另外可以把微生物作为生物反应器来生产植物次生代谢产物,但是在酵母菌或者大肠杆菌中青蒿素生物合成代谢途径不完整,不能直接获得青蒿素,只能获得青蒿酸等前体物质,为青蒿素的半合成提供便利。所以,目前看来利用黄花蒿植物体生产青蒿素仍然是最高效,可行,环保的方法。近年来,随着青蒿素的生物合成途径一步步被阐明,代谢途径上的基因已经从不同物种或者黄花蒿中被克隆,并且在微生物或者植株中进行了功能验证。其中有一部分基因通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法被转入黄花蒿,直接在黄花蒿中进行功能验证,获得了青蒿素含量提高的转基因黄花蒿,这些基因包括：hmgr、fps、ads和sqs大量研究表明植物转基因技术能有效改变植物次生代谢产物的组分和含量,所以本研究通过采用转基因技术于段,在黄花蒿中超量表达青蒿素生物合成途径上的。cyp71avl基因和cpr（cyp71avl的氧化还原伴体基因）以提高青蒿素含量。细胞色素P450（cytochromes P450,CYP）是含有亚铁血红素的一个超家族单链蛋白,它们在自然界中分布极为广泛,并且参与生物体内一些生命过程,或者发挥着重要的调节作用。CYP的成员与CO结合后紫外条件下能检测到其在波长为450nm处特有的吸收峰。紫穗槐二烯羟化酶（amorpha-4,11-diene hydroxylase,CYP71 AV1）和细胞色素P450还原酶（cytochrome P-450 reductase.CPR）就是CYP家族其中的两个成员,在黄花蒿中对青蒿素的生物合成起着重要作用。在青蒿素生物合成特有的代谢途径上紫穗槐二烯羟化酶是一个多功能酶,能连续催化由紫穗槐二烯到青蒿醇,从青蒿醇到青篙醛,最后从青蒿醛到青蒿酸的三步反应,由此可见,cyp71av1基因在青蒿素生物合成中扮演着重要角色。为此,构建了含有cyp71av1和cpr两个基因的双价载体pCAMBIA1304+cyp71avl-cpr,并将此双价载体转化到根癌农杆菌LBA4404中获得工程菌LBA4404-pCAMBIA1304+cyp71avl-cp。再用此含有两个目的基因的工程菌对黄花蒿叶片进行遗传转化,潮霉素作为抗性筛选压力,采用跨35S启动子设计检测引物的方法同时检测抗性基因hygr,目的基因cyp71av1和cpr,结果有4个黄花蒿株系同时检测到以上3个基因,确立这4个株系为转基因黄花蒿株系。高效液相色谱（附带蒸发光散射检测器）（high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detector, HPLC-ELSD）含量结果表明：4个转基因黄花蒿株系和野生型黄花蒿相比,青蒿素含量都有提高,含量最高达干重2.44 mg/g非转基因为0.91 m/g),提高1.7倍,最低（1.46 m/g）提高0.6倍。同时,通过荧光定量PCR（Real-Time PCR,QT-PCR）测定cyp71avl和cpr两个基因的相对表达量,以β-actin基因作为内参基因。结果显示：同非转基因黄花蒿相比,有3个转基因黄花蒿株系的cyp71av1和cpr基因的表达量都提高了,并且cyp71av1基因表达量较cpr表达量提高较为明显。H PLC-ELSD和QT-PCR结果表明：在黄花蒿中超量表达内源基因cyp71av1和cpr能提青蒿素含量。通过该转基因方法获得的转基因黄花蒿新品系可以作为产业化生产青蒿素的原始材料,解决青蒿素紧缺的问题,满足市场上对青蒿素的大量需求,为疟疾的治愈贡献一份力量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 青蒿素与疟疾
• 1.1.1 疟疾介绍
• 1.1.2 青蒿素介绍
• 1.1.3 黄花蒿介绍
• 1.1.4 黄花蒿腺毛体-青蒿素合成、分泌、存储的场所
• 1.2 黄花蒿中的部分次生代谢产物分析
• 1.2.1 青蒿素衍生物
• 12.2 黄花蒿中挥发性次生代谢产物
• 1.2.3 黄花蒿中的非挥发性次生代谢产物
• 1.2.4 黄花蒿中几种次生代谢产物的化学结构式
• 1.3 青蒿素生物合成代谢途径
• 1.3.1 青蒿素生物合成上游途径（MVA和MEP途径）
• 1.3.2 青蒿素生物合成下游途径
• 1.3.3 黄花蒿中已获得的转基因成果
• 1.4 影响黄花蒿中青蒿素含量的因素
• 第二章 绪论
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 研究的内容和范围
• 2.3 本研究的技术路线
• +cyp71av1-cpr高效植物表达载体的构建'>第三章 LBA4404-pCAMBIA1304⁺cyp71av1-cpr高效植物表达载体的构建
• 3.1 实验材料及试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 仪器设备
• 3.1.4 试剂及试剂盒
• 3.2 常规实验方法和步骤
• 3.2.1 总RNA的提取与检测
• 3.2.2 目的条带的回收
• 3.2.3 连接反应
• 2法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞的'>3.2.4 CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞的
• 3.2.5 连接产物或重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.6 质粒的提取
• 3.2.7 重组子的鉴定、测序
• 2法）'>3.2.8 农杆菌LBA4404感受态的制备（CaCl₂法）
• 3.2.9 重组质粒转化感受态农杆菌
• 3.2.10 RNA反转录成cDNA
• +-cyp71av1-cpr高效植物表达载体的构建及工程菌的获得'>3.3 pCAMBIA1304⁺-cyp71av1-cpr高效植物表达载体的构建及工程菌的获得
• 3.3.1 植物总RNA提取
• 3.3.2 引物设计
• +构建'>3.3.3 pCAMBIA1304⁺构建
• +cyp71av1-cpr载体构建'>3.3.4 pCAMBIA1304⁺cyp71av1-cpr载体构建
• 3.3.5 农杆菌工程菌的获得
• 第四章 转基因黄花蒿的获得及分析
• 4.1 实验材料和常规方法步骤
• 4.1.1 实验材料及仪器设备
• 4.1.2 常规方法及步骤
• 4.2 工程菌遗传转化黄花蒿
• 4.2.1 黄花蒿无菌苗的获得
• 4.2.2 工程菌两次活化
• 4.2.3 工程菌侵染黄花蒿
• 4.2.4 暗培养
• 4.2.5 抗性筛选培养
• 4.2.6 生根培养
• 4.2.7 黄花蒿炼苗
• 4.2.8 黄花蒿田间试验
• 4.3 转基因黄花蒿鉴定
• 4.4 青蒿素含量测定
• 4.4.1 青蒿素提取
• 4.4.2 HPLC-ELSD测定青蒿素含量
• 4.5 荧光定量PCR测定cyp71av1、cpr和β-actin基因的表达量
• 4.6 结果与分析
• 4.6.1 转基因黄花蒿的检测和鉴定
• +-cyp71av1-cpr对黄花蒿的遗传转化'>4.6.2 LBA4404-pCAMBIA13O4⁺-cyp71av1-cpr对黄花蒿的遗传转化
• 4.6.3 转cyp71av1和cpr基因黄花蒿青蒿素含量分析
• 4.6.4 cyp71av1和cpr基因表达量分析
• 4.7 结论和展望
• 参考文献
• 附录
• 附录A：实验室常用培养基和抗生素配置
• 附录B：发表论文情况
• 附录C：缩略词
• 致谢