视蛋白基因3（OPN3）对人肺癌A549细胞紫杉醇耐药性作用机制的初步研究

论文摘要

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康,以非小细胞肺癌多见,而化学治疗是其主要的治疗手段。但随着化疗药物的广泛使用,肿瘤耐药性也不断出现,严重影响了治疗效果。耐药性是由基因决定的,因此,发现和研究肿瘤耐药性相关基因及其作用的分子机制,有助于进行针对性的临床治疗,为研究新的药物作用靶点和治疗方法提供依据,其已成为当前肿瘤防治研究的重点课题。本室前期研究表明,与淡色库蚊对杀虫剂抗性相关视蛋白基因高度同源的人视蛋白基因3（Opsin3,OPN3）与人肺癌A549细胞紫杉醇耐药性相关,推测其可能作为G蛋白偶联受体（GPCR）成员,参与了肺癌A549细胞对紫杉醇的耐药机制。本研究采用G蛋白偶联受体信号通路基因芯片,对A549紫杉醇敏感细胞转染OPN3及其空载体对照组、A549PTX紫杉醇耐药细胞干涉OPN3及其空载体对照组共4种细胞系,紫杉醇处理前后2种状态,共8组样品进行高通量筛选,以研究OPN3对其他G蛋白偶联受体及GPCR下游信号通路的影响:采用定量PCR及Western Blot验证目的基因及蛋白质表达差异,研究其对A549细胞紫杉醇耐药影响的可能机制。结果表明,OPN3可以抑制c-Jun表达,从而降低下游基因转录、抑制细胞增殖,增加肿瘤细胞对药物的敏感性。同时,本研究采用使用annexin V/propidium iodide（PI）双染,流式细胞仪结合荧光显微镜对芯片实验样本细胞进行凋亡检测。结果表明,OPN3相对表达水平与A549细胞在紫杉醇处理下的凋亡水平正相关,提示OPN3可能还上调细胞凋亡信号通路,诱导细胞凋亡,这一结果与前期3H-TdR增殖试验结果相符。本研究初步研究了OPN3在肺癌耐药性中的功能,首次发现OPN3对A549细胞紫杉醇耐药性的影响包括抑制c-Jun表达和促进细胞凋亡2方面,为深入研究视蛋白基因在耐药性产生机制中的作用、发现新的肿瘤基因治疗位点奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1.细胞系
• 1.2.主要试剂
• 1.3.主要溶液配方
• 1.4.主要仪器
• 2.方法
• 2.1.基因芯片
• 2.2.荧光定量PCR
• 2.3.Western Blot
• 2.4.细胞凋亡检测
• 结果
• 1.基因芯片
• 1.1.RNA提取
• 1.2.芯片基本数据
• 1.3.数据分析
• 2.荧光定量PCR
• 2.1.RNA提取
• 2.2.OPN3转染/干涉效果验证
• 2.3.BCL-2、CCND1、c-Jun、EDG-2表达水平验证
• 3.Western Blot
• 3.1.蛋白质定量
• 3.2.Western Blot鉴定c-Jun表达差异
• 4.细胞凋亡检测
• 4.1.流式细胞仪检测
• 4.2.荧光显微镜检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录:糖原分支酶基因（NYD—GBE）的初步功能研究
• 致谢
• 综述:胰蛋白酶在肿瘤发生发展中的作用