蚜虫中sid-1基因的克隆与进化分析

论文摘要

Sid-1基因的编码蛋白是系统性RNAi通路中发挥重要作用的跨膜蛋白，目前sid基因的研究较少，搜索不同生物基因组中的sid-1基因，已在细菌、线虫、昆虫、鱼和哺乳动物等十多种生物中发现了sid-1基因的相似序列，但并非所有这些动物均具有sid-1类似基因。本研究对已进行基因组测序的哺乳动物进行基因组搜索，结果在牛、猩猩、大鼠和人类的基因组中均发现了1-3个sid-1基因的相似序列，而在羊、猪、猫的基因组序列中却未发现sid-1基因的同源序列。在昆虫中，已报道蜜蜂、家蚕、赤拟谷盗和美洲沙蝗都有1-3个sid-1基因的相似序列，而果蝇、冈比亚按蚊基因组中缺少sid-1同源序列。本文根据已有sid-1同源基因的保守氨基酸序列，设计简并引物，对棉蚜、麦长管蚜、禾谷缢管蚜、桃蚜等进行sid-1基因的克隆，最终分别从棉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜中克隆获得了sid-1同源基因（GenBank登录号为EF533711、EF533712、EF533713），其碱基序列相似性为90％-98％，推导的氨基酸序列同源性为96％-99％。进一步采用RACE技术成功扩增了棉蚜同源基因的全长，其氨基酸序列与预测的家蚕sid-1基因的相似性为38％-42％，与蜜蜂为44％，与赤拟谷盗为32％-44％，与美洲沙蝗sid-1基因片段为53％，与线虫仅为25％，但其拓扑学结构非常相似，表明克隆的是目标基因。该结果首次证实了同翅目昆虫体内具有sid-1同源基因。结合已报道的sid-1基因，建立了不同生物sid-1基因的亲缘树。从建立的sid-1基因亲缘树来看，该基因的分布广泛，从细菌到哺乳动物都有，且不同生物体内sid-1的同源性与生物的亲缘关系和进化地位明显相关。这说明sid-1是进化上较原始的一类基因，各种生物体内应该普遍存在。另一方面，从不同类型生物sid-1同源基因的相似性来看，其相似性均较低，细菌、线虫、昆虫和脊椎动物之间的相似性均不超过30％，也说明这些基因具有很长的独立进化史。另外，从本研究克隆的3种蚜虫的sid-1同源基因的相似性来看，它们的相似度极高（96％-99％），这说明该基因在蚜虫体内承担着重要功能，并承受着巨大的选择压力。由此可以推测，一些缺少sid-1同源基因的生物，可能进化了其他补偿途径，这些都有待进一步研究证实。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 RNAI的原理
• 1.2 RNAI细胞核内调控通路
• 1.3 RNAI在细胞内发生的亚细胞体
• 1.4 系统性RNAI
• 1.4.1 线虫中的系统性RNAi
• 1.4.2 蜜蜂中的系统性RNAi
• 1.4.3 果蝇中的细胞自主性RNAi
• 1.4.4 人类中的系统性RNAi
• 1.4.5 德国小蠊中的RNAi
• 1.4.6 蝗虫中的RNAi
• 1.4.7 其他昆虫中的RNAi
• 1.5 SID-1基因的研究
• 1.6 其他与系统性RNAI有关的基因
• 1.7 可移动的信号分子
• 1.8 实现系统性RNAI的试验技术
• 1.9 本论文的研究目的
• 第二章 蚜虫中SID-1基因CDNA片段的克隆与序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试棉蚜、麦长管蚜和禾谷缢管蚜
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.2 实验步骤
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 单链cDNA的合成
• 2.2.3 PCR引物设计
• 2.2.4 PCR反应
• 2.2.5 PCR产物克隆与测序
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 连接产物的转化
• 2.2.8 质粒DNA测序
• 2.2.9 序列分析
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 三种蚜虫中克隆的目标基因片段
• 2.3.2 目标基因片段的同源性
• 2.4 讨论
• 第三章 棉蚜SID-1基因CDNA全序列的克隆与序列分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试虫与饲养
• 3.1.2 主要试剂和仪器
• 3.2 实验步骤
• 3.2.1 RNA提取及cDNA第一链的合成
• 3.2.2 PCR引物设计
• 3.2.3 PCR反应条件及体系
• 3.2.4 PCR产物回收与纯化
• 3.2.5 连接反应与连接产物的转化
• 3.2.6 重组质粒的提取及质粒DNA测序
• 3.2.7 在线工具分析Apsid-1序列
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 棉蚜sid-1基因cDNA及其推导氨基酸序列
• 3.3.2 讨论
• 第四章 SID-1系统进化树分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 sid-1基因氨基酸序列
• 4.1.2 sid-1氨基酸序列分子亲缘树的构建
• 4.2 结果与分析
• 第五章 德国小蠊乙酰胆碱酯酶基因的干扰研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试虫与饲养
• 5.1.2 主要试剂和仪器
• 5.2 试验步骤
• 5.2.1 德国小蠊总RNA提取（TRIzol法）
• 5.2.2 德国小蠊ace1/ace2干扰片段的确定和克隆
• 5.2.3 反转录,单链cDNA的合成
• 5.2.4 PCR扩增
• 5.2.5 PCR产物回收与纯化
• 5.2.6 PCR产物回收与纯化
• 5.2.7 连接反应与连接产物的转化
• 5.2.8 重组质粒的提取及质粒DNA测序
• 5.2.9 ace1/ace2干扰片段体外转录生成dsRNA
• 5.3 德国小蠊活体注射
• 5.3.1 dsRNA梯度浓度稀释
• 5.3.2 乙酰胆碱酯酶的活性测定方法
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 沉默的有效时间观察
• 5.4.2 沉默有效浓度梯度测定
• 5.4.3 基因干扰的行为观察
• 5.5 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录:攻读硕士学位期间已发表第一作者研究论文