土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）瓜氨酸酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

论文摘要

瓜氨酸已被证明是一种显著的临床检测标记。但是,目前临床上直接检测瓜氨酸的检测方法在实际操作中具有一定的难度。土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）瓜氨酸酶（citrulline ureidase, CTU, EC3.5.1.20）催化瓜氨酸反应生成鸟氨酸,C02和NH3。通过检测产物浓度的变化来衡量瓜氨酸的浓度是一条操作简单且可行的途径。瓜氨酸酶对快速检测人体内的瓜氨酸的含量有极为重要的作用。本研究采用在大肠杆菌中表达瓜氨酸酶CTU783、CTU858及鸟氨酸氨基甲酰转移酶（Ornithine carbamoyl transferase, OCT, EC 2.1.3.3）。为了在大肠杆菌中表达具有可溶且有活性的瓜氨酸酶,选择pET-22b（+）载体,使目标蛋白在周质空间表达,且有His-tag便于纯化,构建了3个基因的重组载体并转化BL21（DE3）宿主,成功表达和纯化了3种重组目的蛋白。为了提高目的蛋白表达量和溶解性,从多个方面研究了外在条件对CTU858的可溶性表达的影响,发现35℃下,pH 7.5,添加1%的山梨醇,添加0.25 mM IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导表达6h时,CTU858蛋白的可溶性表达显著提高。采用Ni2+金属螯合亲和层析分离目的蛋白,再经梯度透析和超滤浓缩后得到目的蛋白液。先采用薄层层析定性分析3种重组蛋白和酶活测定,发现CTU858具有瓜氨酸酶活性,进一步采用PITC（异硫氰酸苯酯）柱前衍生HPLC定量测定可溶性CTU858、CTU783及包涵体CTU858的活性,发现可溶性CTU858具有瓜氨酸酶活性,酶浓度为6080 U/L,比活力为12.02 U/mg,包涵体CTU858部分复性,CTU783不具有瓜氨酸酶活性。最后研究了利用瓜氨酸酶-谷氨酸脱氢酶（GLDH）偶联体系进行瓜氨酸测定的方法和影响因素,对最适底物浓度、pH、温度、GLDH及ADP的浓度等进行了研究。探讨了该体系用于检测瓜氨酸浓度的可行性,该研究对人体瓜氨酸的酶检测方法的发展具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 瓜氨酸
• 1.1.1 瓜氨酸代谢
• 1.1.2 瓜氨酸临床功能
• 1.1.3 瓜氨酸的检测
• 1.2 瓜氨酸酶的研究进展
• 1.2.1 瓜氨酸酶的来源
• 1.2.2 瓜氨酸酶的应用
• 1.2.3 瓜氨酸酶酶活测定及影响因素
• 1.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 载体
• 1.3.2 宿主菌
• 1.3.3 pET表达载体
• 1.3.4 优化可溶性表达
• 1.3.5 包涵体
• 1.3.6 重组蛋白的分离纯化
• 第二章 瓜氨酸酶基因查找、载体构建及克隆表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株、载体及主要培养基
• 2.1.2 主要供试试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 大肠杆菌转化及重组瓜氨酸酶表达
• 2.2.3 重组瓜氨酸酶的表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Genbank查找目的基因
• 2.3.2 CTU783,CTU858,OCT基因克隆载体的构建及鉴定
• 2.3.3 CTU783,CTU858,OCT重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 重组CTU858蛋白表达条件的优化
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株及主要培养基
• 3.1.2 供试试剂及仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌体破碎方法的选择
• 3.2.2 诱导时间对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.2.3 温度对CTU858表达的影响
• 3.2.4 添加物对CTU858表达的影响
• 3.2.5 IPTG浓度对CTU858表达的影响
• 3.2.6 培养基pH对CTU858表达的影响
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 菌体破碎方法的选择
• 3.3.2 诱导时间对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.3.3 温度对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.3.4 添加物对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.3.5 IPTG浓度对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.3.6 培养基pH对瓜氨酸酶表达的影响
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 重组瓜氨酸酶蛋白的分离纯化及活性测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株及主要培养基
• 4.1.2 供试试剂及仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 可溶性CTU783,CTU858,OCT蛋白分离纯化及酶活测定
• 4.2.2 CTU858包涵体复性及酶活测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 可溶性CTU783,CTU858,OCT分离纯化及复性
• 4.3.2 TCL初步鉴定可溶性CTU783,CTU858,OCT酶活
• 4.3.3 柱前衍生HPLC定量鉴定酶活
• 4.3.4 CTU858包涵体分离纯化及复性
• 4.3.5 CTU858包涵体酶活测定
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 瓜氨酸酶偶联法测定测定瓜氨酸浓度的可行性初探
• 5.1 材料
• 5.1.1 供试菌株及主要培养基
• 5.1.2 供试试剂及仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 底物浓度对酶偶联体系的影响
• 5.2.2 pH的选择
• 5.2.3 温度的选择
• 5.2.4 辅酶ADP浓度的选择
• 5.2.5 GLDH量的选择
• 5.2.6 酶偶联法的线性范围和检测限
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 底物浓度对酶偶联体系的影响
• 5.3.2 pH的选择
• 5.3.3 温度的选择
• 5.3.4 辅酶ADP浓度的选择
• 5.3.5 GLDH量的选择
• 5.3.6 酶偶联法的线性范围和检测限
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读期间发表的学术论文