论文摘要
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）引起的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给当前世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,APP的自然感染或试验感染能够诱导抗多种异源血清型的保护。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。由本实验室贝为成博士以本室分离鉴定的APP HB株血清7型菌为亲本株构建的胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株HBC-/GFP+,经免疫的Balb/C小鼠和仔猪能够抵抗APP同源血清型（7型）的攻击,对同血清7型APP的攻击保护率为100%,但对异源血清1型的攻击保护率只有75%。为了进一步提高HBC-/GFP+突变株对异源血清菌株的免疫效力,论文设想以该基因缺失菌株为载体表达apxⅠA基因,构建新的基因工程重组菌株。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的预防和控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验（HIA）,该方法具有血清型特异性,不适合于对APP进行普查。补体结合试验（CFT）特异性高,但敏感性低,而且有时产生假阳性结果,加上操作复杂,只适合于实验室应用,难以进行田间推广。乳胶凝集试验（LAT）是一种简便快速的检测方法,在应用过程中也出现了不同血清型之间的交叉反应。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法操作简便,结果易于判定,已成为广泛应用。TonB系统在胸膜肺炎放线杆菌在活体内铁的摄取具有重要作用,至今已有2种TonB系统在APP中报道,即TonB1和TonB2。而TonB2蛋白在APP所有血清型菌株感染过程中都能获得表达,且具有种特异性。因此,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。鉴于上述背景,本研究我们开展了以下工作:1.apxⅠA基因的克隆及重组胸膜肺炎放线杆菌菌株apxⅡC-/apxⅠA+的筛选和鉴定依据GenBank中公布的apxⅠA基因序列（D16582）,以APP血清1型基因组DNA为模板,设计特异性引物,采用PCR扩增3069bp apxⅠA基因序列,序列测定证实无误后连接到穿梭载体pJFFNX中,获得重组穿梭质粒pJFF-IA。采用电转化将重组穿梭质粒DJFF-IA转化基因工程突变株HBC-/GFP+。首先在含氯霉素（1μg/ml）的TSA抗性平板上筛选过夜培养,然后经PCR鉴定到阳性克隆子,命名为apxⅡC-/apxⅠA+。通过生长试验和遗传稳定性试验对重组菌株的一些生物学特性进行了研究。2.ApxⅠA基因在基因工程突变株HBC-/GFP+中表达特性研究胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因编码ApxⅠ外毒素的结构蛋白。在TSB培养基中加入适宜的辅酶Ⅰ（NAD）以及钙离子后,培养重组菌过夜,离心后取上清,利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀上清液,用PBS重悬沉淀,透析3天后进行鉴定,SDS-PAGE和Western-blot结果表明:ApxⅠA蛋白在基因工程突变株HBC-/GFP+中获得稳定表达。3.重组胸膜肺炎放线杆菌菌株apxⅡC-/apxⅠA+对仔猪的免疫效力研究为了评价基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+对仔猪的免疫效力,将基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+（活菌含量1×108CFU）通过气管和肌肉注射两种途径,间隔两周,免疫仔猪两次,同时设TSB为对照。用ApxⅠ-ELISA、ApxⅡ-ELISA检测毒素ApxⅠ、ApxⅡ抗体,第二次免疫2周后,连同TSB对照,用APP血清1型（活菌含量1×108CFU）通过滴鼻对免疫仔猪进行攻毒。结果表明:气管注射途径免疫基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+的仔猪对APP血清1型菌攻击的保护率为100%（5/5）,肌肉注射途径免疫的基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+仔猪对APP血清1型菌的保护率为80%（4/5）,基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+免疫仔猪攻毒后没有表现出明显的临床症状,剖检肺部病变不明显;TSB对照组临床症状明显,剖检肺部严重出血。抗体检测和攻毒结果显示出基因工程重组菌株apxⅡC-/apxⅠA+免疫仔猪对于强毒APP1的感染后保护效果较亲本菌株HBC-/GFP+（75%）有显著提高,能显著降低临床发病,减轻肺部病变,有望研制成弱毒疫苗用于猪传染性胸膜肺炎的免疫预防。4.tonB2基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达根据GenBank上发表的猪胸膜肺炎放线杆菌tonB2基因序列（AY428647）,设计并合成引物,通过PCR扩增tonB2基因全长858bp。将其克隆到原核表达载体pGEX-KG上,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,TonB2蛋白以包涵体形式获得高效表达,经过Western blotting检测证明该表达产物具有良好的抗原性。5.TonB2-ELISA诊断方法的建立及初步应用以纯化后的表达产物作为诊断抗原包被酶标板,通过间接ELISA方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为1:160（4.03μg/mL）和最佳血清稀释倍数1:40。对338份临床送检血清及APP生物Ⅰ型12个标准阳性血清进行检测,同时与APP间接血凝检测试剂盒平行检测对比,阳性符合率为92.8%,阴性符合率为84.2%。该方法的初步应用结果表明,建立的TonB2-ELISA检测方法不仅具有很好的敏感性和特异性,而且可检测APP所有生物Ⅰ型血清型的感染,适合用于基层猪场APP普查。
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