稻瘟病菌定殖与扩展相关基因MgGLK1,MgMFS1和MgHAP的克隆与功能分析

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）作为引起水稻最严重病害的病原,同时也作为研究病原菌与植物互作的理想模式生物,对其致病机理的研究不仅有利有于对稻瘟病菌的科学防治,同时对研究其它真菌的致病机理也具有很重要的意义。本文克隆了水稻与稻瘟病菌互作时定殖与扩展阶段特异性表达的三个基因,分别对它们进行基因敲除和过量表达,获得突变体。通过突变体表型分析,以初步确定其在稻瘟病菌侵染过程中的作用。MGG10005.6和MGG01877.6是在定殖与扩展中表达上调较大的基因而MGG05058.6是表达量下调最大的基因。通过基因敲除得到了MGG10005.6、MGG01877.6和MGG05058.6三个基因的敲除突变体,分别命名为MgGLK1,MgMFS11和MgHAP。突变体表型分析结果显示,MgGLK1缺失突变体生长速度略有减慢,产孢量减少,分生孢子萌发和附着胞形成的相对于野生型均稍有延迟;突变体菌株致病性与野生型无明显差异。MgMFS1基因敲除突变体菌株的生长速度、产孢量、分生孢子形态和附着胞萌发均不受影响。MgHAP缺失突变体,产孢量比野生型KU80有所减少,是野生型的52%,而且分生孢子萌发和附着胞形成相对于野生型均稍有延迟,对水稻叶片致病性略有减弱。通过对MgHAP过量表达突变体表现分析,发现其产孢、附着胞形成和致病性均与野生型无显著区别。综上所述,MgGLK1和MgHAP可能参与控制稻瘟病菌产孢和孢子萌发的功能,在病菌侵染过程中担当一定作用,但不是致病性所必不可少的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 稻瘟病与稻瘟病菌
• 1.2 稻瘟病菌的侵染循环
• 1.2.1 稻瘟菌孢子产生和萌发
• 1.2.2 附着胞的形成和侵染钉分化
• 1.2.3 侵染性菌丝的扩展
• 1.3 稻瘟病菌的重要功能基因
• 1.3.1 产孢相关基因
• 1.3.2 参与附着胞形成和侵染的基因和信号识别途径
• 1.4 甘油激酶概况
• 1.4.1 甘油激酶的生物学特性
• 1.4.2 甘油激酶研究现状及应用
• 1.5 MFS transporter 的概况
• 1.5.1 MFS transporter 生物学特性
• 1.5.2 MFS transporter 的研究现状及应用
• 1.6 本研究的目的、内容与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试质粒
• 2.1.3 供试植物
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 生化试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 目的蛋白的序列获得与分析
• 2.2.2 PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 产物胶回收
• 2.2.4 PCR 产物的TA 克隆
• 2.2.5 大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化
• 2.2.6 质粒DNA 的提取
• 2.2.7 质粒的酶切与连接
• 2.2.8 MgGLK1、MgMFS1 和MgHAP 敲除载体的构建
• 2.2.9 MgHAP 过量表达载体的构建
• 2.2.10 稻瘟病菌原生质体的制备及转化
• 2.2.11 稻瘟病菌基因组DNA 的快速提取方法
• 2.2.12 稻瘟病菌菌丝Total RNA 的提取
• 2.2.13 RT-PCR
• 2.3 基因敲除突变体表型鉴定
• 2.3.1 菌落生长速度测定
• 2.3.2 孢子量统计及形态观察
• 2.3.3 孢子萌发及附着胞形成观察
• 2.3.4 大麦离体接种试验
• 2.3.5 水稻致病性鉴定
• 2.3.6 洋葱表皮侵染实验的观察
• 2.3.7 检测菌株细胞完整性实验
• 3 结果与分析
• 3.1.MgGLK1，MgMFS1 和MgHAP 基因的生物信息学分析
• 3.2 MgGLK1，MgMFS1 和MgHAP 基因敲除突变体的获得
• 3.2.1 MgGLK1、MgMFS1 和MgHAP 基因敲除载体的构建
• 3.2.2 MgGLK1，MgMFS1 和MgHAP 基因敲除突变体的筛选与验证
• 3.3 MgHAP 过量表达突变体的获得
• 3.3.1 MgHAP 过量表达突变体载体的构建
• 3.3.2 MgHAP 过量表达突变体的筛选与验证
• 3.4 突变体的表型分析
• 3.4.1 MgGLK1 基因敲除突变体的表型分析
• 3.4.2.MgMF51 基因敲除突变体表型分析
• 3.4.3 MgHAP 基因敲除突变体和过量表达突变体的表型
• 4. 小结与讨论
• 4.1 MgGLK1 与分生孢子和附着胞发育有关
• 4.2 MgMFS1 基因敲除突变体的致病性无明显变化
• 4.3 MgHAP 基因作为分泌蛋白可能对稻瘟病菌的致病性有关
• 参考文献
• 附录1
• 致谢