水稻苗/穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定

论文摘要

水稻对稻瘟病的抗性存在较大的差异,一些品种不但具有广谱抗性且具有全生育期抗性,而另一些品种不但对不同病原菌小种的抗性反应不同,而且不同生育期对同一病原菌小种的抗性反应也不同。为了探讨小种特异抗性和生育期特异抗性的分子基础,第一,选用穗期对稻瘟病抗/感反应差异的一对水稻品系,利用抑制消减杂交（SSH）,分离水稻对穗瘟防卫反应相关基因;第二,选用一个具有小种特异抗性的水稻品种,分离水稻.稻瘟病非亲和/亲和互作中差异表达的基因,并对筛选到的差异表达基因在不同生育期的表达进行了RT-PCR分析。为了进一步研究差异表达基因的功能,还构建了水稻抗稻瘟病苗期和穗期两个全长cDNA文库。选用遗传背景相近、对叶瘟抗性相同但对穗瘟抗性不同的两个水稻株系,利用SSH构建穗瘟抗/感消减cDNA文库,经差异筛选及序列分析,共获得90个独立的差异表达cDNA克隆。利用RT-PCR分析了26个所筛选到的cDNA克隆在抗/感植株接种后的表达,17个基因的表达差异得到验证。对这些基因在穗期抗/感植株中接种稻瘟菌后的表达谱进行RT-PCR分析,它们在抗/感植株中受稻瘟菌感染后或被诱导或被抑制,但在抗/感植株中被诱导和被抑制所发生的时间以及程度不同。推测Ca2+信号传导途径在水稻防卫穗瘟过程中起着重要的调节作用,以同一水稻品种中156接种不同稻瘟菌小种,通过SSH构建水稻-稻瘟菌非亲和/亲和互作消减cDNA文库,结合差异筛选,经序列测定及RT-PCR分析,共获得25个独立的经验证的差异表达cDNA克隆,并对它们在苗期水稻-稻瘟病菌非亲和/亲和互作早期的表达谱进行了分析,被检测基因在非亲和/亲和互作零点的表达水平相同,而在接种后,它们的表达发生变化,说明所有这些变化都是由于接种引起的;在两种不同的互作反应中,大部分基因的表达变化趋势一致,但存在程度的差异;少数基因表达变化在两种互作中不一致,说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关,肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。部分基因在穗期受不同稻瘟病菌小种侵染后也发生变化,但变化趋势与苗期有所不同。信息学功能分析表明,苗期和穗期所筛选到的参与水稻稻瘟病防卫反应的基因,都涉及到病原菌或环境胁迫应答、信号传导、转录、蛋白合成与修饰、代谢、转座等生物学功能。本研究表明,无论在穗期或苗期,还是寄主特异或小种特异抗性的防卫反应中,大多数参与水稻对稻瘟病防卫反应的基因在抗病和感病反应过程中都被诱导或被抑制,这些基因可能作为基础抗性基因参与到防卫反应过程中,但由于它们表达发生变化的时间和程度的差异而导致了抗性反应的不同;而少数基因在抗/感反应过程中受病原菌侵染后的表达变化趋势存在较大差异,甚至呈现完全相反的变化趋势,这些基因可能在抗病反应过程中起主要的调节作用。但苗期和穗期对稻瘟病的防卫反应存在一定的差异,因此推测,由于一些参与防卫反应的基因不但受病原菌小种的诱导,而且也受水稻本身生长发育的调节,从而产生了病原菌小种特异抗性和寄主生育期特异抗性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图及附表清单
• 第一章 绪论
• 1.1 植物抗病的分子生物学基础
• 1.1.1 植物抗病基因的结构
• 1.1.2 R蛋白的结构赋予了它的功能
• 1.2 R基因与Avr基因的互作
• 1.2.1 受体-配体模式
• 1.2.2 警戒模式
• 1.3 植物抗病的特异性
• 1.3.1 病原菌小种特异抗性的分子基础
• 1.3.2 广谱抗性的分子基础
• 1.4 信号传导相关因子的克隆及结构
• 1.5 植物防卫反应相关基因
• 1.6 水稻抗病性的分子机理研究进展
• 1.6.1 水稻的抗病基因
• 1.6.2 水稻的防卫反应相关基因
• 1.7 植物基因克隆方法
• 1.7.1 抑制差减杂交技术的基本原理
• 1.7.2 抑制消减杂交法的特点
• 1.7.3 SSH技术在植物基因克隆中的应用
• 1.8 展望
• 1.9 本研究的背景和意义
• 第二章 水稻穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定
• 2.1 材料方法
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 稻瘟菌接种
• 2.1.3 总RNA提取和mRNA分离
• 2.1.3.1 总RNA提取
• 2.1.3.2 mRNA的分离
• 2.1.4 抑制消减杂交
• 2.1.5 SSHcDNA文库的构建
• 2.1.6 消减cDNA文库的差异筛选
• 2.1.7 测序及序列相似性搜索
• 2.1.8 差异表达克隆的RT-PCR分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 SSHcDNA文库的构建
• 2.2.2 文库的差异筛选与BLAST同源性分析
• 2.2.3 差异表达cDNA克隆的功能分类
• 2.2.4 正向和反向文库中差异表达克隆的比较
• 2.2.5 穗瘟抗感反应进程中cDNA克隆的RT-PCR分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 SSH技术和差异筛选
• 2.3.2 SSH在水稻抗稻瘟病研究中的应用
• 2.3.3 抗病和感病反应中差异表达基因的异同
• 2.3.4 水稻穗瘟防卫反应相关基因的功能分析
• 2+信号传导途径'>2.3.5 水稻穗瘟抗性过程中的Ca²⁺信号传导途径
• 第三章 水稻对不同小种稻瘟菌抗性差异表达基因的鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 水稻材料
• 3.1.2 稻瘟病菌的接种
• 3.1.3 抑制消减cDNA文库的构建和差异筛选
• 3.1.4 cDNA序列测定及BLAST同源性分析
• 3.1.5 差异表达基因的RT-PCR分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 消减cDNA文库的构建和差异筛选
• 3.2.2 筛选的差异表达基因BLAST搜索与功能分类
• 3.2.3 差异表达基因在苗期非亲和/亲和互作中的表达谱分析
• 3.2.4 筛选的基因在穗期受稻瘟病菌侵染后的表达谱分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 非亲和/亲和互作中的差异表达基因的筛选
• 3.3.2 苗期非亲和/亲和互作中差异表达基因的表达
• 3.3.3 差异表达基因在苗期和穗期受稻瘟病菌侵染后的表达分析
• 第四章 水稻抗稻瘟病全长cDNA文库的构建
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 水稻材料与稻瘟病菌接种
• 4.1.2 全长cDNA文库的构建
• 4.1.3 文库质量的检测
• 4.1.4 噬菌体λTriplEx2转变为质粒pTriplEx2
• 4.1.5 质粒DNA的提取
• 4.1.6 文库插入cDNA大小的分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 总RNA的提取和mRNA的纯化
• 4.2.2 cDNA的合成及其分级分离
• 4.2.3 cDNA文库的质量分析
• 4.3 讨论
• 第五章 总结
• 5.1 研究结果
• 5.1.1 水稻穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定
• 5.1.2 水稻小种特异抗性防卫反应相关基因的分离与鉴定
• 5.1.3 水稻苗期和穗期抗稻瘟病全长cDNA文库的构建
• 5.2 结论
• 5.2.1 SSH技术和差异筛选
• 5.2.2 水稻对穗瘟的防卫反应相关基因
• 5.2.3 水稻对不同稻瘟病菌小种的防卫反应
• 5.2.4 水稻对稻瘟病防卫反应
• 5.3.5 与前期工作的比较
• 5.4 本研究的创新点
• 5.5 下一步工作
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历