鸡大肠杆菌重组1型菌毛粘附特性及fimH基因克隆

论文摘要

鸡大肠杆菌1型菌毛是最常见的大肠杆菌附属物,是一种毛发样蛋白突起。它是由1型菌毛基因簇编码的,包括fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG及fimH等基因,其中结构基因为fimA及fimH。1型菌毛是鸡大肠杆菌的致病因子,通过它对宿主呼吸道上皮细胞的粘附,使细菌得以定居、移行,从而获得侵袭的通道。鸡大肠杆菌的这种粘附特性被认为与fimH蛋白有关,且由甘露糖受体介导。本研究试图弄清fimH基因及其编码的fimH蛋白在细菌粘附过程中的作用,分析fimH基因变异情况,并评价fimH蛋白在免疫原性上的意义。用构建的含有鸡大肠杆菌1型菌毛操纵子基因的二个重组菌CZYR9（pBG-HB101,含fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG,缺失fimH）及CZYR10（pBH-HB101, pBG-HB101,含fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG及fimH全基因）,采用透射电镜观察了这二个重组菌株,发现在营养肉汤中于37℃培养均表达菌毛,但在18℃培养不表达菌毛;用37℃培养的大肠杆菌CZYR9及CZYR10对鸡气管粘膜做粘附试验,并用扫描电镜观察,发现CZYR10对体内体外的鸡气管均可粘附,但18℃培养的大肠杆菌均缺乏这种粘附作用,而对CZYR9即使是37℃培养也不能粘附;采用抗1型菌毛血清做粘附抑制试验测定,结果是抗1型菌毛血清能显著抑制野生型YR10及重组型CZYR10菌株对气管上皮的粘附。采用甘露糖抑制试验发现CZYR10及野生型YR10对气管上皮的粘附作用均可被甘露糖显著抑制。以上试验结果表明甘露糖对介导菌体对气管粘膜上皮细胞受体起重要作用,而fimH与温度依赖性无关,但与粘附作用是相关的。分别提取鸡致病性大肠杆菌MG（011）、GL7（O78）及YR10（O18）基因组模板,根据Genbank上发表的序列设计、合成了一对引物,对其1型菌毛fimH基因进行了扩增、序列测定,并分别与国外标准1型菌毛K-12菌株的fimH基因序列进行了比较。结果表明:核酸同源性MG10对K-12为97.89%、GL7对K-12为97.56%、YR10对K-12为98.22%,预测氨基酸顺序相似性分别为98.33%、98.33%、99.00%。而预测氨基酸序列变化YR10（O18）与K-12仅第48位氨基酸由V变为A,第196位氨基酸由R变为P,第222位氨基酸由H变为T;O78、O18与K-12仅第48位氨基酸由V变为A,第91位氨基酸由N变为S,第99位氨基酸由S变为N,第196位氨基酸由R变为P,第222位氨基酸由H变为T;其余核苷酸无变化。通过DNASTAR软件对fimH蛋白二级结构图谱、抗原位点图谱、亲水性图谱进行预测分析,我们发现它们二级结构、抗原位点及亲水性基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列未见明显变异。用具有1型菌毛的3种菌株（全基因重组菌CZYR10、野生型YR10和缺失fimH基因的重组菌CZYR9）,大容量培养后提取菌毛制备3种菌毛油乳剂疫苗。将1日龄罗曼小公鸡随机分为5组,每组15只,分别隔离饲养至第7天,第1、2、3组,分别是野生菌毛免疫、缺失fimH菌毛免疫组和全基因重组1型菌毛组。每雏分别经颈部皮下接种油乳剂苗,1周后同法加强免疫一次,每只每次剂量均为0.5ml（含0.25mg）,同时设第4、5组分别为阳性和阴性对照组。在二免2周后开始攻毒,用含1型菌毛的致病性大肠杆菌YR10（O18）菌株（含量为1×1010CFU/ ml）经后胸气囊攻毒,剂量为0.5ml/只。攻毒后各组隔离观察2周,统计发病率、死亡率及病理变化。第1、2、3组死亡率分别为13.33%、33.33%、26.67%,第4组阳性对照死亡率为73.33%、第5组阴性对照死亡率为0;第1、2、3组鸡群在肝脏、心包、气囊的病变比第4组轻微,差异显著（P<0.05）。从而说明,两种重组1型菌毛蛋白具有免疫保护作用,重组1型菌毛疫苗的保护力比野生型1型菌毛疫苗保护率稍低,但差异不显著;全基因重组1型菌毛蛋白与缺失fimH基因重组1型菌毛疫苗的保护力也没有明显差异。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 1 型菌毛的研究进展
• 1 概述
• 2 菌毛的组成及其形态结构
• 3 菌毛的表达
• 4 菌毛的生物学特性
• 5 菌毛的检测方法
• 6 菌毛在感染中的作用
• 7 菌毛基因簇结构
• 8 菌毛的免疫特性
• 9 1 型菌毛作为大肠杆菌表面呈现系统
• 参考文献
• 第二章 鸡大肠杆菌重组 1 型菌毛粘附特性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 鸡大肠杆菌1 型菌毛fimH 基因克隆与序列测定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 鸡大肠杆菌重组1 型菌毛的免疫原性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 致谢