论文摘要
肝纤维化是各种慢性肝病所共有的病理学的变化，也是向肝硬化甚至肝癌发展的中心环节。而肝星状细胞是肝脏中形成纤维的主要细胞类型。当肝脏受到损伤时，肝星状细胞在各种因素的刺激下被激活成肌成纤维样细胞（myofibroblast like cell，MFBLC），大量的增殖，表达、分泌和重塑胶原及非胶原的基质蛋白，以及致纤维化和致炎的细胞因子和化学因子，和金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP），导致纤维在肝脏中积累形成肝纤维化。而在肝纤维化的消退过程中伴随着激活的肝星状细胞的凋亡，这样一是减少了基质蛋白的来源，同时对基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinasc，MMP）的抑制剂也减少了。所以诱导肝星状细胞的凋亡成为了治疗肝纤维化的潜在策略。因为肝纤维化是各种肝脏疾病的前期病变，如果能在此阶段对病情进行治疗或抑制，将大大降低肝病恶化的可能性。近年的研究证实AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的过表达可以诱导大鼠肝细胞、成神经瘤细胞以及MIN细胞的凋亡，但整个凋亡的信号通路还不足很清楚。AMPK是细胞内能量状态的感受器，当细胞内AMP和ATP的比值升高到一定程度时，AMPK就会被激活。AMPK可以抑制短期内不影响细胞存活的消耗ATP的合成代谢通路，而激活生成ATP的分解代谢通路。但当AMPK在细胞中过表达时，它可以激活c-Jun氨基末端蛋白激活（JNK）的活性，通过转录因子c-Jun的作用调节蛋白的表达，并通过caspase家族的作用最终导致细胞凋亡。AMPK是由α、β、γ三个亚基组成的蛋白激酶，其中α亚基是催化亚基，β、γ是调节亚基。5-氨基咪唑-4+甲酰胺核苷酸（5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside，AICAR）是研究中应用较多的AMPK激活剂。AICAR是腺苷的类似物，它在细胞里转换为环腺苷-磷酸衍生物5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranosyl-5-monophate（ZMP）。ZMP是AMP的类似物，具有激活AMPK的作用。但值得注意的是，AICAR是介导嘌呤生物合成的物质，同ZMP、ZDP和ZTP一样它还有其它细胞效应，并非AMPK的特异激活剂。随着对AMPK研究的深入，研究者已经发现截短的AMPKα亚基1—312氨基酸的肽段不再与β和γ亚基结合，但是保留了大部分的酶活性，并且此截短的肽段172的苏氨酸突变成天冬氨酸后，可以阻止蛋白磷酸酶对它的去磷酸化失活作用，从而具有了组成性的激酶的活性。有研究者已经构建了可以在真核细胞中表达此肽段的重组腺病毒，为进一步研究AMPK的作用提供了很好的工具。本实验用表达组成性激活的AMPK的腺病毒（Ad-AMPK）感染肝星状细胞株LX2，证实了重组腺病毒可以高效的介导AMPK在LX2细胞中的过表达，并且最终诱导了细胞的凋亡。对凋亡信号通路的进一步研究发现，Bcl-2在LX2中是低表达的，而Bax在AMPK过表达之后，表达增加，而用RNAi方法敲低Bax之后，细胞再用携带AMPK基因的腺病毒感染，LX2细胞不再发生凋亡，说明Bax参与了AMPK诱导LX2凋亡的信号通路。本实验的主要结果和结论如下：1．用重组腺病毒介导组成性的AMPK在LX2细胞中过表达。以腺病毒滴度pfu为100感染LX2细胞，在不同的时间（24、48、72h）收获细胞，用免疫印记的方法检测外源AMPK的表达，发现在48h之前外源AMPK的表达检测不到，而在72h表达明显增加。说明AMPK的表达在48h到72h之间，并且其活性至少可以持续到72h。后续的试验中在72h收获细胞。2．LX2细胞感染Ad-AMPK后，用PI单染流式细胞仪检测到有凋亡特征性的亚二倍体峰出现，提示LX2细胞发生了凋亡；并且细胞DNA出现凋亡特征性的梯状条带，进一步说明细胞发生了凋亡。3．LX2细胞感染Ad-AMPK后，免疫印记检测到Bax表达上调，pro-cascpasc-3减少，说明casepase-3前体被激活形成了活性的凋亡执行蛋白casepase-3，而Bcl-2在LX2细胞中是低表达的，说明AMPK介导的LX2细胞的凋亡是和线粒体上Bcl-2家族是有密切关系的。4．用RNAi的方法将Bax敲低之后，再用Ad-AMPK感染LX2细胞，细胞不再容易成团，并从培养瓶底脱落，发生凋亡，而是长势良好。5．用RNAi的方法将Bax敲低之后，再用Ad-AMPK感染LX2细胞，pro-casepase-3与对照组差异变得很小，RNAi Bax抑制了AMPK诱导LX2细胞凋亡的作用。同时说明Bax是AMPK诱导LX2细胞凋亡通路上的重要分子。总之，本实验以诱导肝星状细胞凋亡可以缓解肝纤维化为导向，证实AMPK的过表达可以诱导肝星状细胞株LX2的凋亡，希望对肝纤维化的临床治疗有一定的借鉴意义。同时对AMPK诱导LX2凋亡的信号通路进行了进一步的研究，为AMPK诱导细胞凋亡的信号通路增加了一个新成员——Bax。