钙离子在镉致体外培养大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用

论文摘要

为探讨钙离子（Ca2+）在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用,本研究用孕18-19d SD大鼠的胎鼠建立了大脑皮质神经细胞的模型,观察不同时期的细胞形态,NSE免疫组化法鉴定细胞纯度。在细胞培养液中添加不同浓度的醋酸镉（0、5、10、20μmol/L）以及10μmol/L细胞内Ca2+螫合剂BAPTA-AM,使其单独或联合作用于细胞12h,观察镉对细胞的形态学损伤；利用MTT法测定镉及BAPTA-AM对细胞存活率的影响；利用流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞内Ca2+浓度、ROS水平、线粒体膜电位（△ψm）；荧光定量PCR法测定钙调蛋白（CaM） mRNA表达；分光光度计法测定细胞膜ATPase的活力。结果表明：①神经细胞培养至第六天形态最佳、活力最强,是用于进一步实验的最佳时期；NSE纯度鉴定结果表明,培养至第六天的细胞纯度可达95%以上。②镉暴露引起细胞形态的变化,使胞体变小,网络消失；影响细胞核的形态,产生凋亡小体。上述变化呈现一定剂量—效应关系。③镉暴露可使细胞存活率降低,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞存活率呈现上升趋势。④细胞凋亡率随染毒浓度的增加呈上升趋势,BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈下降趋势；⑤细胞内Ca2+浓度随染毒浓度的增加显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）,BAPTA-AM联合组与相应染毒组相比均呈降低趋势,10μmol/L组差异极显著（P<0.01）,20μmol/L组差异显著（P<0.05）；⑥细胞内ROS水平升高,随染毒浓度的增加呈降低趋势,但仍显著高于对照组（P<0.05）,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较,细胞内ROS水平均明显降低,其中5μmol/L组差异显著（P<0.05）,10μmol/L组差异极显著（P<0.01）。⑦线粒体膜电位随染毒浓度的增加呈降低趋势,10μmol/L组表现极显著（P<0.01）,20μmol/L组差异显著（P<0.05）,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较呈现升高趋势,其中20μmol/L组差异极显著（P<0.01）；⑧细胞膜ATPase活性随染毒浓度的增加呈现显著或极显著的下降（P<0.05或P<0.01）,与20μmol/L染毒组相比,BAPTA-AM联合作用组Na+-K+-ATPase活性显著升高（P<0.05）,Ca2+-Mg2+-ATPase活性极显著升高（P<0.01）；⑨与对照组相比,20μmol/L组CaM mRNA表达极显著降低（P<0.01）,其余无明显变化,BAPTA-AM联合组与相应染毒组比较20μmol/L组极显著升高（P<0.01）,其余无明显变化。结论：①不同浓度镉暴露可降低神经细胞存活率,损伤细胞形态；②不同浓度镉暴露可使细胞凋亡率升高,细胞内Ca2+浓度升高,ROS水平升高,△ψm降低,细胞膜ATPase活性降低,CaM mRNA表达量降低；③加入BAPTA-AM后,可明显缓解镉引起的各项指标的变化,提示细胞内钙超载在大脑皮质神经细胞凋亡过程中发挥重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 上篇 文献综述
• 第一章 镉及其对中枢神经系统的毒性研究进展
• 1 镉及其毒性
• 2 镉对中枢神经系统（CNS）的影响
• 2.1 镉致CNS的形态学改变
• 2.2 镉致CNS生化的改变
• 2.3 镉致中枢行为活动的改变
• 2.4 镉对CNS影响的作用机制
• 第二章 镉诱导细胞凋亡机制的研究进展
• 2+)调节的凋亡通路'>1 镉与钙离子(Ca²⁺)调节的凋亡通路
• 2 镉与线粒体调节的凋亡通路
• 3 镉与MAPK调节的凋亡通路
• 4 镉与内质网调节的凋亡通路
• 5 镉与死亡受体调节的凋亡通路
• 第三章 细胞内钙离子研究进展
• 2+的平衡'>1 细胞内Ca²⁺的平衡
• 2+浓度的调节'>2 胞内游离Ca₂₊浓度的调节
• 2.1 质膜上的钙转移系统
• 2.2 细胞内的钙转移系统
• 下篇 研究内容
• 第一章 镉对大鼠大脑皮质神经细胞的形态学损伤
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 培养板包被处理
• 2.3 大脑皮质神经细胞的分离及培养
• 2.4 大脑皮质神经细胞的形态学观察
• 2.5 大脑皮质神经细胞的纯度鉴定—免疫组化法
• 2.6 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响—MTT法
• 2.7 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤
• 3 结果
• 3.1 大脑皮质神经细胞的形态学观察
• 3.2 大脑皮质神经细胞纯度的鉴定结果
• 3.3 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响
• 3.4 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤
• 4 讨论
• 4.1 大脑皮质神经细胞的分离培养
• 4.2 大脑皮质神经细胞纯度的鉴定
• 4.3 镉对大脑皮质神经细胞存活率的影响
• 4.4 镉对大脑皮质神经细胞的形态学损伤
• 4.5 镉对大脑皮质神经细胞核形态的影响
• 2+在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用'>第二章 Ca²⁺在镉致大鼠大脑皮质神经细胞凋亡中的作用
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 各实验组镉浓度
• 2+螯合剂BAPTA-AM浓度的确定'>2.3 细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM浓度的确定
• 2.4 大脑皮质神经细胞培养及染毒
• 2.5 大脑皮质神经细胞凋亡率的测定
• 2+浓度的测定'>2.6 大脑皮质神经细胞内Ca²⁺浓度的测定
• 2.7 大脑皮质神经细胞内ROS水平的测定
• 2.8 大脑皮质神经细胞内线粒体膜电位（△ψm）的测定
• 2.9 大脑皮质神经细胞膜ATPase的测定
• 2.10 大脑皮质神经细胞内CaM mRNA表达的测定
• 2.11 数据分析
• 3 结果
• 3.1 镉与BAPTA-AM对神经细胞存活率的影响
• 3.2 镉与BAPTA-AM对神经细胞凋亡率的影响
• 2+浓度的影响'>3.3 镉与BAPTA-AM对神经细胞内Ca²⁺浓度的影响
• 3.4 镉与BAPTA-AM对神经细胞内ROS水平的影响
• 3.5 镉与BAPTA-AM对神经细胞内△ψm的影响
• 3.6 镉与BAPTA-AM对神经细胞膜ATPase活力的影响
• 3.7 镉与BAPTA-AM对神经细胞内CaM mRNA表达的影响
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢