红色糖多孢菌基因组、转录组和GlnR功能研究

论文摘要

红色糖多孢菌是一种工业上规模化生产红霉素的放线菌。由于红霉素及其衍生物的广泛应用,对红色糖多孢菌的改造以提高红霉素产量的研究非常多。本研究中的红色糖多孢菌HL3168 E3(以下简称E3)即为工业上通过菌种筛选得到的红霉素高产菌。本课题首先从基因组测序和转录组两个方面对红霉糖多孢菌工业生产菌E3和模式菌NRRL23338进行比较研究,发掘红霉素合成调控机制。通过对E3基因组测序发现,与NRRL23338基因组相比,共有60个插入突变,46个缺失突变和584个单碱基突变。通过转录组分析发现E3菌中红霉素合成及其供给途径中的基因发生了显著的表达上调,而氮代谢中的基因明显被抑制。另外,我们综合分析基因组和转录组数据,得到几个可能对E3菌红霉素高产起到关键作用的调控因子。这些发现有助于揭示红色糖多孢菌红霉素合成的调控机制,为基因工程和代谢工程提高红霉素产量提供了理论基础。在此基础上针对氮代谢中的重要转录调控因子GlnR展开相关功能研究,了解其作用机制。通过大肠杆菌克隆表达系统体外表达得到了GlnR蛋白,并用ESMA实验分析验证在氮代谢中有12个操纵子上游调控序列存在GlnR结合位点。基于上述实验结果,利用N4EME在线分析软件预测了可能的GlnR结合保守序列。这为探索红霉素合成调控机制提供了一个新的突破点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）简介
• 1.1.1 红霉素（erythromycin,Er）简介
• 1.1.2 红霉素的生物合成
• 1.1.2.1 与红霉素合成相关的基因
• 1.1.2.2 红霉素合成的生化途径
• 1.1.3 红霉素的基因工程研究进展
• 1.2 功能基因组学
• 1.2.1 DNA水平上的功能基因组学
• 1.2.2 RNA水平上的功能基因组学
• 1.2.3 其他层面的功能基因组学研究
• 1.3 基因表达调控研究方法
• 1.3.1 凝胶迁移率电泳
• 1.3.2 染色质免疫共沉淀技术
• 1.3.3 基因组SELEX技术
• 1.3.4 DNA亲和捕获分析
• 1.4 转录调控因子GlnR
• 1.5 研究目的和意义
• 第2章 红色糖多孢菌基因组测序和转录组研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养基和溶液
• 2.2.4.1 培养基的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 生产菌E3基因组测序
• 2.3.1.1 菌种培养
• 2.3.1.2 E3菌株基因组DNA提取
• 2.3.1.3 生产菌E3基因组测序
• 2.3.1.4 基因组功能注释和分析
• 2.3.2 生产菌E3和野生菌NRRL23338表达谱芯片制备
• 2.3.2.1 菌种发酵培养
• 2.3.2.2 发酵过程中样品效价的测定
• 2.3.2.3 RNA抽提
• 2.3.2.4 总RNA纯度和浓度检测
• 260/OD₂₈₀检测'>2.3.2.5 总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀检测
• 2.3.2.6 RNA电泳
• 2.3.2.7 表达谱芯片杂交
• 2.3.2.8 表达谱芯片数据分析
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 基因组DNA提取
• 2.4.2 发酵过程中样品红霉素效价测定
• 2.4.3 RNA电泳
• 2.4.4 表达谱芯片扫描和数据处理
• 2.5 数据分析与结论
• 2.5.1 S.erythraea E3菌基因组特点及其与NRRL23338比较
• 2.5.2 E3菌和NRRL23338菌转录组分析
• 2.5.2.1 红霉素生物合成途径及其供给途径
• 2.5.2.2 转运蛋白
• 2.5.2.3 能量代谢
• 2.5.2.4 次级代谢产物合成
• 2.5.3 功能基因组分析
• 2.6 讨论
• 第3章 红色糖多孢菌中GlnR转录调控因子功能研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种与质粒
• 3.2.2 药品与试剂
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 常用溶液存储液的配制
• 3.2.4.1 常用缓冲液
• 3.2.4.2 抗生素和IPTG存储液
• 3.2.4.3 培养基
• 3.2.4.4 SDS-PAGE电泳相关溶液
• 3.2.4.5 重组蛋白纯化相关溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 glnR基因的获取
• 3.3.1.1 红色糖多孢菌的培养
• 3.3.1.2 红色糖多孢菌基因组的抽提
• 3.3.1.3 PCR特异扩增目的基因片段
• 3.3.1.3.1 引物设计
• 3.3.1.3.2 PCR扩增获得glnR基因
• 3.3.1.3.3 glnR基因片段的纯化回收
• 3.3.2 pET-28a（+）质粒的抽提
• 3.3.3 glnR基因和pET-28a（+）质粒的酶切、连接
• 3.3.3.1 glnR基因和pET-28a（+）质粒的定量
• 3.3.3.2 glnR基因和pET-28a（+）质粒的酶切
• 3.3.3.3 glnR基因和pET-28a（+）质粒的连接
• 3.3.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α
• 3.3.4.1 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 3.3.4.2 连接产物glnR/pET-28a（+）转化DH5α感受态细胞
• 3.3.4.3 glnR/pET-28a（+）/DH5α的筛选
• 3.3.5 glnR/pET-28a（+）转化表达菌BL21（DE3）
• 3.3.5.1 提取glnR/pET-28a（+）质粒
• 3.3.5.2 制备大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
• 3.3.5.3 重组质粒glnR/pET-28a（+）转化BL21（DE3）感受态细胞
• 3.3.5.4 筛选glnR/pET-28a（+）/BL21（DE3）阳性克隆
• 3.3.6 GlnR蛋白的诱导表达
• 3.3.6.1 IPTG诱导表达GlnR蛋白
• 3.3.6.2 SDS-PAGE电泳检验GlnR蛋白诱导表达情况
• 3.3.7 GlnR蛋白的制备
• 3.3.7.1 纯化目的蛋白His-GlnR
• 3.3.7.2 重组蛋白His-GlnR定量
• 3.3.8 PCR扩增可能的目的结合序列
• 3.3.9 凝胶阻滞分析GlnR调控靶基因
• 3.3.9.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶配制
• 3.3.9.2 EMSA反应体系的建立
• 3.3.9.3 PAGE凝胶染色
• 3.3.10 MEME在线分析GlnR的靶序列
• 3.3.11 验证GlnR结合位点
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 glnR基因的获取
• 3.4.1.1 红色糖多孢菌基因组的抽提
• 3.4.1.2 glnR基因的PCR扩增
• 3.4.2 glnR/pET-28a（+）/BL21（DE3）的构建
• 3.4.2.1 pET-28a（+）质粒的抽提
• 3.4.2.2 glnR基因和pET-28a（+）质粒的酶切、连接
• 3.4.2.3 glnR/pET-28a（+）的转化DH5α的验证
• 3.4.3 GlnR蛋白诱导表达
• 3.4.4 GlnR蛋白的纯化
• 3.4.5 GlnR蛋白定量
• 3.4.6 PCR扩增DNA探针
• 3.4.7 EMSA分析GlnR的靶标基因
• 3.4.8 MEME在线分析GlnR的靶序列
• 3.4.9 验证GlnR结合位点
• 3.5 结论及讨论
• 3.5.1 结论
• 3.5.2 讨论
• 第4章 总结
• 参考文献
• 致谢