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猪不同年龄段骨骼肌的差异甲基化组分析

2020-12-29阅读(707)

猪不同年龄段骨骼肌的差异甲基化组分析

论文摘要

哺乳动物出生后骨骼肌的生长发育属于典型的数量性状,主要受到微效多基因网络所调控,其中大量关键的功能基因和调控元件的转录又受到DNA甲基化的调控。本研究分别采集了3头180天和7年（平均日龄为2475天）金华猪雌性猪的背最长肌组织样品,利用MeDIP-seq测序技术进行全基因组水平DNA甲基化分析,同时还利用基因芯片技术对样本的mRNA转录组进行测定,进而揭示了两个年龄段背最长肌的甲基化以及转录水平的差异。结果如下：1、肌纤维表型差异：7年猪骨骼肌肌纤维平均直径显著高于180天（7年：54.89±10.00μmVs.180天：44.85±8.60μm,P<0.01）；7年猪骨骼肌平均肌纤维横截面面积显著高于180天（7年：2544.70±1035.85μm2vs.180天：1680.96±657.44μm2,P<0.01）2、血清指标差异：7年和180天的猪血清脂蛋白α分别为103.10mg/L和94.10mg/L,两者差异不显著（P>0.05）；180天的胆固醇比7年高31.3%,达到极显著（P=0.004）；180天的低密度脂蛋白比7年的高37.3%,达到显著水平（P=0.03）。表明180天和7年的代谢相关血.清指标存在显著差异。3、6个样品的MeDIP测序总共产生了46Gb原始序列数据（每个样品约为7.67Gb）,通过筛选得到36.6Gb（75.24%）唯一匹配到基因组的非重复序列。（1）对基因组甲基化水平与染色体相关特征指标进行相关性分析,结果表明甲基化程度与染色体长度成极显著的负相关（r=-0.63,p=0.0036）,与GC含量和CpGo/e率成极显著的正相关,相关系数分别为0.787（P<0.01）和0.931（P<0.01）；与每kb的重复数、每Mb的基因数和每Mb的SNP数成正相关,相关系数分别为0.348（P>0.05）、0.516（P<0.05）和0.549（P>0.05）。各染色体的亚端粒区和非亚端粒区之间的甲基化水平存在显著性差异（P<0.05）。（2）24个基因元件之间的甲基化程度存在差异：两个年龄段在高CpG启动子（HCP）和中等CpG启动子（ICP）之间的甲基化程度呈现出极显著差异（P<0.01）;两组在ICP和LCP之间的甲基化程度差异达到极显著（P<0.01）。180天在HCP和低CpG启动子（LCP）之间的甲基化程度则达到显著水平（P=0.0275）,7年的则不存在显著（P=0.135）。表明ICPs更易被甲基化,这种甲基化状态的改变可能在调控相关基因表达和衰老等生物学过程中发挥着重要的作用。对不同基因组位置的CGI和CGI Shore的甲基化程度进行比较,发现甲基化差异主要体现在基因内和基因间的CGI和CGI Shore中。4、差异甲基化区域（DMR）分析：180天和7年的DMR有9,234个,占基因组长度的0.064%,所含CpG数目占基因组CpG总数目的28%。（1）DMR的分布差异：启动子区域内,HCP与LCP相比,DMR在ICP更富集;在D区、I区和P区富集的DMR个数分别是121个（占44%）、82个（占30%）和72个（占26%）；DMR在基因间最为富集,占DMR总数的58.98%;其次为中间的内含子,有2378个,占DMR总数的25.19%。DMR在第一外显子中富集较少；有168个和875个DMR富集在CGI中和CGI Shore中,CGI Shore中DMR数目为CGI中DMR数目的5.21倍。（2）将启动子区域差异甲基化的基因进行功能富集分析,发现这些差异甲基化的基因富集在蛋白调控的丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路等52个GO和Pathway中（228个基因,P=0.05）,所涉及的生物学功能可能影响肌肉组织的生长发育。从一定程度上揭示了两个年龄段的骨骼肌表型差异的分子基础。5、转录水平的差异：（1）芯片数据的可靠性：①芯片的检出率高且集中在61%～69%之间；②芯片的重复性探针变异系数（C.V）在3.5%-6.5%之间,均高于C.V<15%的成功实验标准；③箱图（Box plot）的结果也显示芯片数据具有很相似的离散度,说明标准化的效果比较理想。这些结果均表明本研究结果准确可靠,检测数据能够真实反映基因的表达变化规律。（2）本研究芯片共43,663个探针（以60mer的长度）,检出23,283个探针（占53.32%）表达超过阈值,比对到猪参考基因组（猪10.2版本）对应22,043个基因,有4,184个基因表达量在两组间差异显著（P<0.05）,其中,7年相对180天的上调基因和下调基因分别有2,012个和2,172个。（3）对差异基因进行功能富集分析,得到199个显著的GO和Pathway（3212个基因,P=0.05）,如转化生长因子（TGF）调控的TGF-β受体结合通路、热应激因子（HSF）诱导的热应激蛋白结合通路和整合素、蛋白聚糖、CD36介导的细胞外基质（ECM）受体通路等,揭示了肌肉组织的生长发育及其增龄性的变化可能与这些过程和通路相关。6、甲基化介导的基因表达差异：在3,212个差异表达基因中,有46个启动子区域存在甲基化差异,其中16个基因的启动子甲基化程度与其基因表达量呈正相关（r=0.759,P=0.0007）,如MYO5C、ALDOC和MYL12B等；其它30个基因的启动子甲基化程度与其基因表达量呈负相关（r=-0.647,P=0.0001）,如GPR143、GRN和NTF32等。揭示本研究中发现的差异基因可能参与了肌肉的生长发育及其增龄性变化。比如,KCNB1基因、MyoZl基因和SEPN1基因等。7、为了验证试验的准确性,本试验还利用BSP技术验证了ALDOC和KCNB1基因的甲基化程度,发现两种技术的结果一致。对启动子区域的差异甲基化基因以及差异表达mRNA分别进行功能富集分析,发现甲基化和mRNA差异的基因均富集在生物学粘附、循环系统进程、血液循环、细胞增殖的调控和对内源性刺激的反应、铁离子结合和ATP酶活性6个生物学过程,表明这些过程对生物体的发育具有重要的作用。本研究筛选出了对于猪骨骼肌的生长发育可能具有重要影响和较大研究价值的功能基因,初步揭示了在肌肉生长发育及其增龄性变化中的基因表达调控及局部分子互作机制,以及造成猪肌肉宏观性状表型差异的表观调控模式。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 高频词对照表
  • 第一章 文献综述
  • 1 骨骼肌生长发育及其及其影响因素
  • 1.1 骨骼肌生长发育的规律
  • 1.2 影响肌纤维数量和大小的因素
  • 1.3 研究肌纤维数量和直径对动物生产的意义
  • 1.4 年龄对骨骼肌发育的影响
  • 1.5 调控肌肉生长发育的基因
  • 2 DNA甲基化对骨骼肌生长发育的影响
  • 2.1 DNA甲基化的定义
  • 2.2 DNA甲基化的类型
  • 2.3 DNA甲基化的检测方法
  • 2.4 DNA甲基化改变基因表达的机制
  • 2.5 甲基化与年龄的关系
  • 3 基因芯片技术
  • 3.1 生物芯片
  • 3.2 基因芯片的定义
  • 3.3 基因芯片的分类
  • 3.4 基因芯片的应用
  • 3.5 基因芯片存在的问题
  • 3.6 基因芯片在研究猪肌纤维表达谱的情况
  • 第二章 研究内容与目的意义
  • 1 选题背景和研究内容
  • 2 研究日的与意义
  • 第三章 不同年龄段的骨骼肌肌纤维表型指标测定
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验群体
  • 2.2 样本采集
  • 2.3 主要仪器及试剂
  • 2.4 实验方法
  • 3 结果与分析
  • 3.1 骨骼肌肌纤维的表型指标
  • 3.2 代谢相关的生化指标差异
  • 4 讨论
  • 4.1 肌纤维表型指标差异
  • 4.2 血清指标差异
  • 本章小结
  • 第四章 不同年龄段猪骨骼肌的DNA甲基化图谱
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.2 主要实验仪器设备
  • 2.3 试验所需试剂
  • 2.4 实验方法
  • 2.5 基因组元件的定义
  • 3 结果与分析
  • 3.1 测序数据分析
  • 3.2 基因组CpG%的分布
  • 3.3 染色体甲基化分布特点
  • 3.4 亚端粒区和非亚端粒区的甲基化程度差异
  • 3.5 24个基因元件的甲基化分析
  • 4 讨论
  • 4.1 X染色体与常染色体的甲基化差异
  • 4.2 甲基化程度与染色体特征
  • 4.3 亚端粒区和非亚端粒区的甲基化差异
  • 4.4 24个元件的甲基化差异
  • 本章小结
  • 第五章 不同年龄段猪骨骼肌的甲基化差异
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  • 2.1 差异甲基化区域（DMRs）的鉴定
  • 2.2 启动子区的DMRs功能富集分析
  • 3 结果
  • 3.1 DMRs的汇总情况
  • 3.2 24个基因元件的DMRs分布差异
  • 3.3 启动子区域差异甲基化基因功能富集分析
  • 4 讨论
  • 4.1 24个基因元件的DMR富集差异
  • 4.2 基因功能富集分析
  • 本章小结
  • 第六章 不同年龄段的猪骨骼肌mRNA表达谱差异
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  • 2.1 实验中所用主要仪器
  • 2.2 主要试剂
  • 2.3 Total RNA的提取
  • 2.4 RNA的凝胶电泳检测
  • 2.5 基因芯片的操作过程
  • 3 数据分析
  • 3.1 数据预处理及标准化
  • 3.2 芯片实验自身的质控
  • 3.3 猪基因组芯片探针注释文件的重注解
  • 3.4 差异基因分析
  • 3.5 GO和Pathway分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 RNA质量检测
  • 4.2 芯片的扫描结果
  • 4.3 芯片标准化的结果
  • 4.4 差异基因的聚类分析
  • 4.5 GO和Pathway的富集分析
  • 5 讨论
  • 5.1 重复芯片的必要性
  • 5.2 单通道基因芯片的选择
  • 5.3 基因芯片数据的标准化处理
  • 5.4 聚类分析
  • 5.5 GO和Pathway分析
  • 本章小结
  • 第七章 甲基化介导的基因表达差异分析
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  • 2.1 设备和主要试剂盒
  • 2.2 检测DMRs
  • 2.3 重亚硫酸盐测序
  • 3 结果与分析
  • 3.1 基因功能富集分析
  • 3.2 基因表达和差异甲基化的联合分析
  • 3.3 启动子区域甲基化负调控基因的表达量
  • 3.4 BSP验证结果
  • 4 讨论
  • 4.1 基因富集分析
  • 4.2 21个基因参与肌肉发育的调控
  • 本章小结
  • 第八章 结论与展望
  • 1 主要结论
  • 2 论文创新点
  • 3 下一步要进行的工作
  • 参考文献
  • 致谢
  • 博士在读期间发表的论文
  • 附录

    • 相关论文文献

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