论文摘要
流感是一种流感病毒引起的严重性呼吸道疾病。流感病毒（Influenza virus，Ⅳ）具有高度传染性，能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，导致全球人力资源和物力资源的重大损失。流感病毒的主要表面抗原之一—血凝素（HA），具有高度变异性，致使流感病毒疫苗一般每年都要更换，给疫苗的制备和生产造成了诸多不便。而流感病毒的跨膜蛋白—基质蛋白2（M2蛋白），含有高度保守的抗原表位，是病毒亚型间交叉保护性疫苗的候选抗原。流感病毒变异速度非常快，尤其是当前禽流感病毒逐渐蔓延到人群中，对人类危害越来越大，因此研制出一种新颖的具有广泛保护作用的疫苗对于控制流感病毒流行具有极其重要的意义。本研究选择了A型流感病毒的缺失跨膜区M2以及H1N1和H3N2亚型流感病毒HA的7个保守的B细胞表位和T细胞表位。采用大肠杆菌偏爱的密码子对M2外膜区基因和HA多表位基因进行了优化设计。通过合成引物，利用重叠延伸PCR（OE-PCR）和搭桥式PCR方法分别扩增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜区基因和HA多表位基因，依次克隆到表达载体中，构建重组质粒pET28a+-M2d-HA，经测序表明，插入表达载体中的外源基因的序列与理论设计的基因序列完全一致。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得了高效表达重组融合蛋白的工程菌，表达重组蛋白约占菌体总蛋白总量的45％左右。表达产物以包涵体形式存在，经包涵体处理，亲和层析纯化后，重组蛋白稀释复性，再经阴离子交换层析纯化得到纯度在90％以上的目的蛋白。Western blot结果显示纯化的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。重组蛋白免疫小鼠后，利用ELISA实验检测重组蛋白在小鼠体内获得了很高的抗体免疫水平；利用免疫荧光实验观察，重组蛋白抗血清对MDCK细胞上的流感病毒能够产生很好的抗原性。本研究成功构建了流感病毒M2d-HA抗原多表位重组蛋白表达载体，在大肠杆菌中获得了高效表达；通过基因工程获取较高纯度的M2d-HA重组蛋白，同时对蛋白表达、纯化复性等实验条件进行了初步的探索；在昆明小鼠体内，对该重组蛋白的免疫学效应作了初步的研究，为进一步研究广谱型流感病毒亚单位疫苗提供了很好的理论依据和实验资料，也为流感病毒亚单位疫苗的开发及基础研究奠定了一定的实验基础。
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标签：缺失跨膜区基质蛋白论文; 血凝素多表位论文; 重组蛋白论文; 原核表达与纯化论文; 昆明小鼠论文; 实验论文; 免疫荧光论文;