肺癌低灌注与乏氧的检测、干预及机制探讨

论文摘要

第一部分肺癌低灌注与乏氧的检测与干预肿瘤血管生成（angiogenesis）是指新生血管在肿瘤现有血管基础上形成的过程。研究证实,如果没有新生血管的支持,实体组织中的肿瘤生长直径不会超过2mm。Folkman J.等在转基因动物肿瘤模型的实验中发现,在原位癌向浸润癌发展的过程中,往往伴随着新生血管生成的开始。随后大量的临床研究也证实,血管生成与肿瘤的生长、恶变、转移,以及肿瘤病人的预后有着密切的关系。在过去的几年里,肿瘤的抗血管生成治疗引起了人们极大的研究兴趣,各种抗血管生成药物现已进入各期临床试验阶段。检测肿瘤内部血管生成可通过CT或MRI灌注显像或者SPECT等,肝脏、脑肿瘤的研究较多,而肺部肿瘤灌注的研究很少,目前的研究注意力集中在肿瘤的高灌注,针对肿瘤低灌注特别是肺部肿瘤低灌注的研究尚未见报道。肿瘤低灌注与高灌注同样有着重要意义,微观方面,①肿瘤内低灌注限制了化疗药物的运送,导致药物在瘤体内不均匀分布达不到有效的最大治疗水平的血药浓度,特别对血管内半衰期短的药物更明显;②低灌注直接导致乏氧,糖酵解增加细胞内变酸,对一些化疗药物不敏感,乏氧促使细胞在基因和蛋白质水平发生改变使低灌注区对多种化疗药物耐药;③乏氧的瘤细胞也易于转移,近期的研究表明急性乏氧更易增加转移机会,新生血管结构缺陷,通透性增加以促进了肿瘤的转移。从宏观角度考虑,肿瘤的发生、生长、转移是肿瘤与宿主相互选择与适应的结果,低灌注与乏氧是肿瘤原发部位不能满足其生长需要,使得选择耐受乏氧的瘤细胞,并使瘤细胞脱落转移至其他部位寻找适宜生存的空间。单独抑制血管生成,我们很难阻断促血管生成的所有途径,而且这可能加速上述的选择,使得部分瘤细胞耐药、抵抗放疗,易于转移。乏氧,作为低灌注的一个主要后果,分为急性和慢性乏氧,通过乏氧诱导因子（HIF）促进血管生成因子等基因的表达,促进血管生成,抑制抑癌基因如野生型P53表达,激活癌基因表达,肿瘤的恶性程度更高,耐受放化疗和化疗。乏氧的检测主要有PET和MRI两种方法,前者采用硝基咪唑类示踪剂,因其毒性较大,空间分辨率低（仅4-5mm）,费用昂贵,应用前景不如MRI。最早用于脑功能研究的血氧水平依赖成像（BOLD）技术相对成熟安全,是较好的选择。针对乏氧的治疗措施包括适形放疗,乏氧细胞毒药物,乏氧细胞增敏剂,卡波金吸入等,这些方法多是针对改善肿瘤对放疗耐受,而改善乏氧区对化疗耐受的研究鲜见报道。七叶一枝花,为百合科植物华重楼（Paris polyphylla Smith var.chinensisHara）的干燥根茎,含甾体皂苷称为蚤休苷及蚤体土宁苷,后者水解后生成薯蓣苷。有用于抗肿瘤治疗的记载。其水提物及正丁醇提取物有体外抗肿瘤作用。我们的预试验显示七叶一枝花提取物可能对乏氧造成的肿瘤进展有特殊效果。综上所述,肺癌低灌注乏氧区对于其生长、恶变、转移的重要意义,我们提出血管生成及氧供调节治疗（而不是单纯的抗血管治疗）的假设,通过兔肺移植瘤模型,改良验证检测低灌注和乏氧的方法,从而使预测转移等预后提供帮助;探索七叶一枝花调节肿瘤内部血流灌注,平衡氧供的可行性,以提高肺癌的治疗效果。目的1.建立兔肺移植瘤模型,观察乏氧和灌注对预后的影响。2.观察乏氧低灌注区域内瘤细胞生物学特性。3.初步探讨七叶一枝花的抗肿瘤作用特别是对低灌注及乏氧的影响。方法1.所有实验选用新西兰大白兔。采用瘤组织或细胞悬液直接注入肺及后下肢肌肉内建立移植瘤模型。2.验证MRI灌注显像及BOLD氧水平显像的准确性。3只荷瘤兔行MRI灌注及BOLD检测后与OxyLite氧电极结果相比较。并比较灌注显像与BOLD氧水平显像的一致性。3.MRI BOLD及灌注显象与肿瘤预后相关性检测。1)选取10只雄性新西兰大白兔全身麻醉后仰卧位固定,将0.1ml瘤组织悬液经右前胸壁穿刺注入。2) 10天后行胸部MRI检查,观察成瘤情况。3) 20天后行MRI灌注扫描及BOLD显像。4) 30天时复查常规MRI测量肿瘤大小。5) 45天复查MRI测量肿瘤大小,观察转移情况。继续喂养带瘤兔至死亡。4.观察低灌注区和乏氧区瘤组织相对非低灌注、乏氧区生长和转移的差异。取3周左右下肢带瘤兔一只,行MRI灌注、BOLD及CT扫描,选取低灌注/乏氧区（A区）及非低灌注/乏氧区（B区）,将MR与CT图像融合后,在CT引导下穿刺分别制成细胞悬液A、B备用。4.1将上述细胞悬液A、B在低氧（1%O2,5%CO2）及正常氧分压下培养48h。四氮唑盐（MTT）检测细胞增值及ELISA组蛋白-DNA片断检测调亡,实时定量RT-PCR检测VEGF、HIF表达。4.2取20只健康兔,按体重性别配比分为A、B两组,将AB悬液分别接种于右上肺内,每10天扫描观察其生长速度及转移情况,一月取活检标本通过realtime RT-PCR检测VEGF、HIF表达。5.观察七叶一枝花低灌注区及乏氧区的影响5.1以方法4中的描述制备乏氧区细胞悬液,加入七叶一枝花水提液后在低氧及正常氧分压下培养48h,检测瘤细胞增殖及凋亡的变化。同时行实时定量RT-PCR检测VEGF、HIF表达的改变。5.2取50只健康兔,随机分为5组（D.高剂量七叶一枝花灌胃、E.高剂量七叶一枝花灌胃加5-FU化疗,F.5-FU化疗,G.低剂量七叶一枝花灌胃,H.对照）按照前述方法观察七叶一枝花对肿瘤生长、转移及乏氧灌注的影响。结果1.瘤组织悬液穿刺注入法肺癌模型建立成功率92%。有6%早期出现胸水或胸壁结节,予以剔出。2.BOLD结果与OxyLite氧电极结果一致性较好。3.a MRI灌注与BOLD有良好相关性,二者分布区域一致。b高灌注区体积比例与肿瘤大小,生长速度呈正相关,c低灌注区体积及程变与转移高度正相关,与生存期成负相关。灌注值离均差大小与转移率呈正相关,与生存期呈负相关。BOLD高信号区比例与肿瘤转移、生存期明显相关。4.1)来源于乏氧区的瘤组织（A组）与源于非乏氧区的瘤组织（B组）在低氧条件下培养生长活性显著高于非乏氧区对照细胞。RT-PCR结果显示A组HIFI显著高于B组,VEGF亦高于B组,但不如HIFI升高显著。MTT法细胞增殖速度A组高于B组（P＜0.05）调亡A组低于B组（P＜0.01）。2) A组移植瘤生长速度快于B组A组荷瘤兔生存期短于B组（P＜0.01）。A组转移率高于B组,平均转移时间亦早。一月时活检标本mRNA水平显示A组HIF-1,VEGF均高于B组（P＜0.05）。5.1)七叶一枝花提取液可显著降低正常氧分压下瘤细胞增值率并增加瘤细胞凋亡,这种作用在低氧条件下更为明显。RT-PCR结果显示七叶一枝花提取液可降低低氧条件下瘤细胞VEGF、HIF表达的水平。2)单纯七叶一枝花治疗组肿瘤大小与对照组相比明显减小,但不如5-FU组明显,但前者转移率低于5FU治疗（F）组。七叶一枝花治疗组（D、E、G组）乏氧低灌注区面积比例较其他两组显著降低。前者灌注值离均差亦有明显降低。E组治疗效果最佳。结论1.VX2瘤组织悬液穿刺法建立兔肺移植瘤方法稳定可靠。2.MRI检测乏氧及低灌注面积比例及离均差大小是预测肿瘤预后的满意指标。3.乏氧低灌注区的肿瘤细胞有独特生物学特性,是治疗和预防复发的重点。4.七叶一枝花是一种有希望的干预肿瘤低灌注和乏氧的中药。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 肺癌低灌注与乏氧的检测与干预
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附表
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 Periostin and dentin matrix protein 1（DMP1） are candidate genes for hypoxia and perfusion regulation
• 前言
• PART ⅡA
• Materials and methods
• Results
• Discuss
• Conclusion
• Figures
• PARTⅡ B
• Materials and methods
• Results
• Discuss
• Conclusion
• Figures
• Reference
• 致谢
• 攻读博士期间发表的文章
• 外文论文
• 学位论文评阅及答辩情况表