土壤杆菌ZX09胞外多糖的制备和结构解析以及生物学功能的研究

论文摘要

β-葡聚糖是一类人体和动物不能合成的多糖。因其独特和多样的生物活性,β-（1,3）-D-葡聚糖受到人们的广泛关注。然而,大多数β-（1,3）-D-葡聚糖提取工艺繁琐、产率低并且水溶性差,极大地影响了它们生物活性的发挥。细菌发酵分泌的胞外多糖一般比较容易提取,但是目前关于细菌生产水溶性β-（1,3）-D-葡聚糖的报道较少。因此,发现能够分泌可溶性胞外β-（1,3）-D-葡聚糖的菌株、提取可溶性β-葡聚糖并深入研究它的结构和性质,对于更好的利用和发挥β-（1,3）-D-葡聚糖的生物学功能有着非常重要的意义。本实验室从山东海滨的盐土土样中分离培养出一株耐盐的新菌株ZX09。菌株ZX09能在含7.0% NaCl的无机盐培养基中生长,且能分泌产生大量水溶性胞外多糖。通过形态结构、生理生化特征的测定,ZX09菌细胞呈杆状,可利用的碳源有蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖,不可利用淀粉、麦芽糖和纤维素,还能够在PDA培养基和LB培养基上生长。16S rDNA同源性分析鉴定该菌为土壤杆菌（Agrobacterium sp.ZX09）。将2倍体积的95%乙醇加到ZX09菌发酵液中,所得沉淀烘干即可得到胞外多糖的粗品-索拉胶（Salecan）。研究了ZX09菌胞外多糖产量最高时的发酵条件,优化后得到Htm发酵培养基：磷酸二氢钠1 g,硝酸钾3 g,氯化镁0.2 g,无水氯化钙0.07 g,氯化亚铁0.0125 g,硫酸锰0.003 g,氯化锌0.0075 g,蔗糖30g,水1000 ml,pH 7.0-7.2。接种量为10%时,发酵48 h,发酵液粘度和产胞外多糖量达到稳定,索拉胶最高产量达20克/升以上。将发酵48 h的发酵液接入新的发酵培养基中发酵48 h并连续重复上述操作20次,不会造成发酵液的污染和索拉胶产量的下降。因此,Agrobacterium sp.ZX09发酵得到的胞外多糖性质稳定、产量高、提取工艺简便。索拉胶中各化学组分含量分别为总糖77.16%、蛋白6.20%、灰分10.28%、水分5.20%。去蛋白和DEAE纤维素分离纯化后发现,索拉胶中主要含有一种多糖。Sephorose CL-4B测定多糖分子量约为2×106Da。薄层层析和气相色谱分析同时得出D-葡萄糖是胞外多糖分子中唯一的单糖。分析中未见硫酸基、糖醛酸等修饰基团的存在。傅里叶红外光谱、高碘酸氧化、1H NMR和13C NMR的测定推出胞外多糖化学结构为以下单元重复：→3)-β-D-Glcp-（1→3）-[β-D-Glcp-（1→3）-β-D-Glcp-（1→3）]3-α-D-Glcp-（1→3）-α-D-Glcp-(1→。索拉胶中的多糖是一种结构新颖的（1→3）-β-D-葡聚糖。索拉胶具有水溶性,能溶于水形成高粘度的溶液。研究了各种因素对索拉胶溶液流变性质的影响,包括剪切速率（0.001-1000 s-1）、浓度（0.3%、0.5%、1.0%和1.5%）、温度（5℃-95℃）、加热和冻融、pH（1.0-13.0）、振荡频率（0.1-100 rad）和盐离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+）。结果表明索拉胶溶液为非牛顿假塑性流体,剪切曲线在剪切速率低于0.1 s-1时存在一个牛顿平台,而剪切速率高于0.1 s-1具有剪切变稀的特性。溶液浓度越高粘度越大,幂率方程可以很好地描述剪切变稀行为。5℃-95℃的升温过程中索拉胶溶液存在溶胶／凝胶相转化现象。加热和冻融对一定浓度的索拉胶溶液影响不大,很广的pH范围内溶液可以保持稳定的粘度。所有样品动态振荡过程中储能模量G’>耗能模量G",证明流体的粘弹性中弹性占主导地位。盐离子可以提高索拉胶溶液的粘度和粘度随温度变化的稳定性。溶液高粘度、稳定的流变特性预示了索拉胶可以作为增稠剂应用于食品中。进行了索拉胶喂养ICR小鼠的急性和亚慢性毒理试验。所有试验中未见小鼠食用索拉胶后的死亡或行为异常。急性毒性试验发现,小鼠一次性灌喂索拉胶的半致死剂量大于3000 mg/kg。90天的亚慢性毒性试验中,ICR小鼠被分为四组,食物中索拉胶的含量分别为0%、1.0%、2.5%和5.0%。所有索拉胶食物组小鼠的健康、体重、摄食量和临床病理学参数（血细胞指标、生理生化指标和器官组织）均与对照组相近,并且没有与索拉胶剂量高低相关的现象,唯一发现不同的一点是索拉胶喂食的雌鼠空腹血糖低于对照组雌鼠。另外,索拉胶可以明显增加粪便的含水率,有利于粪便的排出。毒理结果表明食品中添加5%或低于5%的索拉胶可以放心食用,它不会对动物的健康带来不利的影响。体外试验证明,索拉胶不能被α-淀粉酶降解,并且能够抑制小鼠胰α-淀粉酶对淀粉的降解。禁食小鼠喂食索拉胶,餐后血糖没有明显上升；喂食含有索拉胶的食物,餐后血糖明显低于对照小鼠。因此,索拉胶可望用来制作控制糖尿病人餐后血糖的保健食品或药物。所有研究表明,索拉胶作为一种新型水溶性β-葡聚糖,提取工艺简单且产量高,具有优良的流变特性和生物活性,食用安全,可应用于食品、制药等行业。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 课题的研究背景
• 1.2 微生物胞外多糖的提取与分离纯化
• 1.2.1 胞外多糖的提取
• 1.2.2 粗多糖中蛋白的去除
• 1.2.3 多糖的脱色
• 1.2.4 多糖的分离与纯化
• 1.3 多糖的组成和结构分析
• 1.3.1 分子量的确定
• 1.3.2 多糖结构的化学测定方法
• 1.3.3 多糖结构分析的酶降解法
• 1.3.4 多糖结构分析的免疫学法
• 1.3.5 多糖结构测定的仪器分析法
• 1.4 多糖溶液的流变学性质研究
• 1.4.1 流体类型
• 1.4.2 非牛顿流体的粘弹性
• 1.4.3 影响聚合物流变性能的因素
• 1.4.4 几类常见微生物多糖溶液的流变行为
• 1.5 微生物胞外多糖的应用
• 1.5.1 工业
• 1.5.2 农业
• 1.5.3 食品
• 1.5.4 医学
• 1.5.5 环境治理
• 1.6 β-葡聚糖的研究现状
• 1.6.1 β-葡聚糖的分类
• 1.6.2 β-葡聚糖的生物活性
• 1.6.3 β-葡聚糖的提取与水溶性
• 1.7 本课题的意义、主要研究内容和实施方案
• 2 耐盐菌株ZX09的初步鉴定以及产胞外多糖特性
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 菌株来源与培养
• 2.1.4 ZX09菌的初步鉴定方法
• 2.1.5 ZX09菌发酵产胞外多糖的测定方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 菌种培养
• 2.2.2 ZX09菌株的初步鉴定
• 2.2.3 土壤杆菌Agrobacterium sp.ZX09发酵产胞外多糖的研究
• 2.3 本章小结
• 3 土壤杆菌ZX09产胞外多糖索拉胶的组成和索拉胶多糖分子结构的分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 胞外多糖的提取、制备、纯化以及分子量的确定方法
• 3.1.4 索拉胶化学组成的测定方法
• 3.1.5 索拉胶中多糖结构的测定方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 ZX09菌胞外多糖的制备、分离纯化以及分子量
• 3.2.2 索拉胶的化学组成
• 3.2.3 索拉胶中多糖结构的测定与分析
• 3.3 本章小结
• 4 索拉胶溶液的流变性质
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 索拉胶的制备和溶液配制
• 4.1.4 稳定剪切的流变特性测定
• 4.1.5 动态振荡的流变特性测定
• 4.1.6 温度对索拉胶溶液流变性质的影响
• 4.1.7 酸碱度对索拉胶溶液流变性质的影响
• 4.1.8 盐离子对索拉胶溶液流变性质的影响
• 4.1.9 统计方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 稳态剪切与动态振荡
• 4.2.2 温度对索拉胶溶液流变性质的影响
• 4.2.3 酸碱度对索拉胶溶液流变性质的影响
• 4.2.4 盐离子对流变特性的影响
• 4.3 本章小结
• 5 索拉胶的急性毒性和亚慢性毒性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 试验动物
• 5.1.4 急性毒性分析
• 5.1.5 亚慢性毒性分析
• 5.1.6 统计方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 索拉胶的急性毒性分析
• 5.2.2 索拉胶的亚慢性毒性分析
• 5.3 本章小结
• 6 索拉胶对餐后血糖的控制作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 主要仪器
• 6.1.3 试验动物
• 6.1.4 索拉胶对α-淀粉酶的体外抑制试验
• 6.1.5 索拉胶对小鼠餐后血糖的控制试验
• 6.1.6 统计方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 索拉胶对α-淀粉酶的体外抑制作用
• 6.2.2 索拉胶对小鼠餐后血糖的控制作用
• 6.3 本章小结
• 7 结论
• 7.1 研究小结
• 7.2 本文创新点
• 7.3 本课题的发展趋势
• 致谢
• 参考文献
• 发表文章与申请专利