几种抗炎药物在人角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中作用位点的研究

论文摘要

一类以银屑病和变应性接触性皮炎为代表的慢性炎症性皮肤病,是当前皮肤科研究重点之一。这类疾病以密集的活化T淋巴细胞浸润为特征,T淋巴细胞释放淋巴因子,影响角质形成细胞的免疫功能,而皮肤又为T淋巴细胞介导的免疫反应的启动和维持提供了一个复杂的微环境,皮肤浸润的T淋巴细胞和角质形成细胞之间的相互作用在这类炎症性皮肤病的发病机制中起关键作用。这类疾病以Thl淋巴细胞占优势,IFN-y是Thl淋巴细胞分泌的重要细胞因子之一,也是调节皮肤炎症和免疫反应最有效的促炎因子,这类炎症反应也被称为IFN-y依赖性炎症反应。角质形成细胞是IFN-y作用的主要靶细胞,IFN-y活化角质形成细胞,使其表达许多趋化因子、细胞因子和膜分子,指导相应的特殊细胞亚群募集至皮肤并使他们活化,参与并放大炎症反应。在这些众多趋化因子中,IL-8负责募集多形核中性粒细胞在表皮内聚集,ICAM-1参与角质形成细胞与炎性细胞间的黏附。因此,对角质形成细胞中IFN-γ信号转导机制研究,有助于对Th1占优势的皮肤炎症反应提出合理治疗方法,以及有助于新型抗炎药物靶点的发现。他克莫司（FK-506）是通过系统应用或外用的免疫抑制、抗炎药物；雷公藤通过口服发挥抗免疫、抗炎作用；丙酸氯倍他索属外用糖皮质激素；盐酸13-己基小檗碱（HB-13）和盐酸13-己基巴马汀（HP-13）是局部外用具有显著抗炎作用的新化合物。本研究以人角质形成细胞永生化株HaCaT细胞为研究体系,以上述药物为目标药物,研究药物对HaCaT细胞中IFN-y信号转导途径的影响。第一章药物对IFN-y上调角质形成细胞IL-8分泌及ICAM-1表达的影响通过ELISA法测定药物对IFN-y刺激的HaCaT细胞IL-8分泌的影响；Cell-ELISA法测定药物对IFN-y刺激的HaCaT细胞表面ICAM-1表达的影响。结果显示：HaCaT细胞在自然状态下能分泌IL-8,rhIFN-y刺激可以上调HaCaT细胞IL-8的分泌水平。FK-506. HB-13和HP-13对IFN-y上调的IL-8分泌均有剂量依赖性的抑制作用,IC50值分别为0.0076μg/mL、0.269μg/mL和0.365μg/mL。HaCaT细胞在自然状态下能表达ICAM-1,500U/mL rhIFN-y刺激后表达升高,表达在刺激6h达到高峰。FK-506、雷公藤内酯醇、丙酸氯倍他索、HB-13和HP-13对IFN-y刺激下HaCaT细胞表面黏附分子ICAM-1表达分别有剂量依赖性的抑制作用,IC50值分别为0.86μg/mL、2.10×10-4μg/mL、0.024μg/mL、0.279μg/mL、0.268μg/mL。本章结果表明,FK-506、雷公藤内酯醇、丙酸氯倍他索、HB-13和HP-13对IFN-y诱导的HaCaT细胞表达炎症性细胞因子和黏附分子有明显抑制作用。第二章药物对角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中IFN-γRα表达的影响通过体外培养的HaCaT细胞,外源性rhIFN-γ作为刺激剂,用Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT细胞后IFN-γRα表达情况,同时研究药物对rhIFN-γ刺激的HaCaT细胞IFN-γRα表达的影响。结果显示：HaCaT细胞在自然状态下可表达少量的IFN-γRα,在500U/mL rhIFN-γ刺激HaCaT细胞5min后,IFN-γRα表达即可上调,刺激后的高表达状态可持续至少2h;250-1000U/mL rhIFN-γ均可诱导HaCaT细胞IFN-γRa表达,各浓度组之间比较无统计学差异；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13,HP-13或丙酸氯倍他索预处理2h可抑制500U/mL rhIFN-γ刺激的HaCaT细胞IFN-γRa表达,IC50值分别为0.43μg/mL、4.94×10-3μg/mL、0.351μg/mL、2.190μg/mL及0.061μg/mL。本章结果表明,用500U/ml rhIFN-γ诱导5min后可使HaCaT细胞IFN-γ信号转导中IFN-γRα蛋白稳定表达；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索通过抑制rhIFN-γ诱导的IFN-γRα表达从而抑制IFN-γ信号转导的启动。第三章药物对角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中JAK2磷酸化的影响通过Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT细胞后磷酸化JAK2（pJAK2）表达情况,并采用（?）Vestern blotting法研究药物对rhIFN-γ刺激的HaCaT细胞pJAK2表达的影响。结果显示：未经刺激的HaCaT细胞不表达pJAK2,500U/mL rhIFN-γ刺激5min即可诱导表达,刺激15min后则不能检测到pJAK2表达；250～1 OOOU/mL rhIFN-γ均可诱导HaCaT细胞pJAK2表达,各浓度组之间比较无统计学差异；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索预处理2h可抑制500U/mL rhIFN-γ诱导的pJAK2表达,IC50值分别为0.224μg/mL、1.02×10-3μg/mL、0.386μg/mL、2.049μg/mL、0.095μg/mL。本章结果表明,用500U/ml rhIFN-γ诱导5min后可使HaCaT细胞中pJAK2蛋白稳定表达；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索通过抑制JAK2磷酸化,而阻断IFN-γ信号转导。第四章药物对角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中STAT-1磷酸化的影响通过Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT细胞后pSTAT-1表达情况,同时研究药物对rhIFN-γ刺激的HaCaT细胞磷酸化STAT-1 （pSTAT-1）表达的影响。结果显示：未经刺激的HaCaT细胞不能表达pSTAT-1,500U/ml rhIFN-γ刺激5min后,pSTAT1表达即可被诱导,这种被诱导表达状态可持续至少2h;250～1000U/mL rhIFN-γ均可诱导HaCaT细胞pSTAT-1表达,各浓度组之间比较无统计学差异。FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索预处理2h可抑制500U/mL rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞pSTAT-1表达,IC50值分别为0.95μg/mL、4.64×10-4μg/mL、0.303μg/mL、2.102μg/mL和0.609μg/mL。本章结果表明,用500U/ml rhIFN-y诱导后30min可使HaCaT细胞中pSTAT-1蛋白稳定表达；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索通过抑制rhIFN-γ诱导的STAT-1磷酸化从而抑制IFN-γ信号转导。第五章药物对HaCaT细胞IFN-γ信号转导途径中SOCS-1表达的影响通过Western blotting法研究rhIFN-γ刺激HaCaT细胞后SOCS-1表达情况,同时研究药物对rhIFN-γ刺激的HaCaT细胞SOCS-1表达的影响。结果显示：未经活化的HaCaT细胞低水平表达SOCS-1,500U/ml rhIFN-γ刺激30min后,SOCS-1表达显著增加,高表达状态可持续4h以上。250～1000U/mL rhIFN-γ均可诱导HaCaT细胞SOCS-1表达增加,各浓度组之间比较无统计学差异。FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索预处理2h可上调IFN-γ刺激的HaCaT细胞SOCS-1表达,ED50值分别为0.015μg/mL、1.10×10-5μg/mL、0.051μg/mL、1.777μg/mL、0.29μg/mL。本章结果表明,用500U/ml rhIFN-γ诱导1h可使HaCaT细胞IFN-γ信号转导中SOCS-1蛋白稳定表达；FK-506、雷公藤内酯醇、HB-13、HP-13或丙酸氯倍他索可通过上调rhIFN-γ诱导的SOCS-1表达,从而抑制IFN-γ信号转导。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 实验材料
• 组织材料
• 药物及化合物
• 仪器及器皿
• 生物及生物化学试剂
• 其他化学试剂
• 第一章 药物对IFN-γ上调人角质形成细胞IL-8分泌及ICAM-1表达的影响
• 第一节 药物对体外培养的HaCaT细胞活力的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 第二节 药物对IFN-γ上调HaCaT细胞IL-8分泌的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 第三节 药物对IFN-γ上调HaCaT细胞ICAM-1表达的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二章 药物对人角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中IFN-γRα表达的影响
• 第一节 rhIFN-y对HaCaT细胞IFN-γRα表达的诱导
• 目的
• 方法
• 结果
• 第二节 药物对rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞IFN-γRα表达的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三章 药物对人角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中JAK2磷酸化的影响
• 第一节 rhIFN-γ对HaCaT细胞pJAK2表达的诱导
• 目的
• 方法
• 结果
• 第二节 药物对rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞pJAK2表达的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四章 药物对人角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中STAT-1磷酸化的影响
• 第一节 rhIFN-γ对HaCaT细胞pSTAT-1表达的诱导
• 目的
• 方法
• 结果
• 第二节 药物对rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞pSTAT-1表达的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第五章 药物对人角质形成细胞IFN-γ信号转导途径中SOCS-1表达的影响
• 第一节 rhIFN-γ对HaCaT细胞SOCS-1表达的诱导
• 目的
• 方法
• 结果
• 第二节 药物对rhIFN-γ诱导的HaCaT细胞SOCS-1表达的影响
• 目的
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 不足与展望
• 文献综述
• 一 药物基因组学与银屑病治疗药物的关系
• 参考文献
• 二 JAK/STAT/SOCS信号转导通路及其在慢性皮肤炎症中的作用
• 参考文献
• 三 角质形成细胞在变应性接触性皮炎和特应性皮炎中的作用
• 参考文献
• 致谢