MPTP诱导的小鼠PD模型及相关脑区iNOS和TNF-α的表达变化

论文摘要

第一部分:MPTP诱导的小鼠PD模型目的:观察MPTP诱导的小鼠PD模型中SNpc和VTA部位的DA能神经元数目变化以及CPu和FrA部位的DA能神经元末梢的退变情况。方法:（1）行为学检测:通过爬杆实验和悬杆实验,分别检测给药后不同时间点小鼠运动迟缓症状和肢体僵硬症状的程度。（2）TH免疫荧光检测:挑选成年雄性8周龄C57BL/6小鼠42只,随机分为两组:①PD模型组（36只小鼠）:每只小鼠按20mg/kg的剂量每2h腹腔注射MPTP 0.1 ml,注射时间恒定,共注射4次,总注射量为0.4 ml;在最后一次注射后取6h、1d、3d、7d、14d、2m共6个时间点。②Saline组（6只小鼠）:与模型组注射时间一致,每只小鼠每两小时腹腔注射NS 0.1 ml。常规灌注、固定、取材后作冰冻冠状位连续切片,行TH免疫荧光检测。（3）统计分析:各检测结果用Stata7.0统计学软件进行单因素方差分析后用Mean±SD表示（差异性水平:﹡p<0.05,﹡﹡p<0.01,﹡﹡﹡p<0.001）。结果:（1）行为学检测结果:3d和7d组T-LA比Saline组明显延长,bar test中肢体僵硬症状的程度比Saline组重,差异有显著性（p<0.05）;14d组T-LA和bar test与Saline组相比,差异无显著性（p>0.05）。（ 2）TH免疫荧光检测结果:Saline组SNpc部位TH阳性DA能神经元染色很深,伴有明显的突起。各模型组中SNpc部位DA能神经元数量与Saline组相比,6h组减少不明显（p>0.05）;1d组减少最明显,达69%（p<0.001）,其DA能神经元突起变短或消失; 3d和7d组分别减少了40%和50%（p<0.01、p<0.001）;14d组只减少了35%（p<0.05）;2m组减少不明显（p>0.05）。VTA部位DA能神经元在形态上与SNpc部位的神经元相似,各模型组DA能神经元在数量上也有所变化:6h组减少不明显（p>0.05）;1d组减少最明显,达23%（p<0.001）;3d和7d组分别减少了13%和16%（p<0.05、p<0.01）;14d组只减少了9%（p>0.05）;2m组减少不明显（p>0.05）。本实验也观察到CPu和FrA部位TH阳性DA能神经元末梢出现了一些变化。通过CPu背外侧区的DA能神经元末梢的TH免疫荧光平均灰度检测发现,模型组中6h组、1d组、3d组、7d组和14d的平均灰度值与Saline组相比均有不同程度的减少（23%～62%）（p<0.05～p<0.001）,而3d组减少最明显,达62%（p<0.001）。FrA脑区的DA能神经元末梢的TH免疫荧光平均灰度检测发现,3d组减少最显著,达25%（p<0.01）。其余各组与Saline组之间没有明显的差异存在（p>0.05）。结论:按20mg/kg的剂量每2h腹腔注射MPTP 0.1 ml,共注射4次所制作的小鼠急性损伤PD模型,操作方便,成功率高,能选择性损伤SNpc部位的DA能神经元和CPu部位DA能神经元末梢,损伤快且严重,而且在行为学上也有改变,能较好的模拟人类PD的神经病理学改变。第二部分:MPTP诱导的小鼠PD模型中相关脑区iNOS和TNF-α的表达变化目的:观察MPTP诱导的小鼠PD模型中CPu、SNpc、FrA和VTA等相关脑区的iNOS和TNF-α在基因和蛋白水平的时程表达变化。方法:（1）RT-PCR:选取MPTP注射后6h、1d、3d和14d等4个时间点的小鼠为实验组（24只小鼠）,Saline对照组（6只小鼠）注射相同剂量的生理盐水。用半定量RT-PCR的方法分析比较不同时间点iNOS和TNF-αmRNA的表达变化。以各泳道中iNOS、TNF-α与GAPDH条带的光密度比值表示iNOS和TNF-αmRNA的相对表达量,通过与Saline对照组比较后用Stata7.0统计学软件进行单因素方差分析,统计结果用Mean±SD表示（差异性水平:﹡p<0.05,﹡﹡p<0.01,﹡﹡﹡p<0.001）。（2）Western blot:选取MPTP注射后12h、1d、3d和14d等4个时间点的小鼠为实验组（24只小鼠）,Saline对照组（6只小鼠）注射相同剂量的生理盐水。用Western blot方法分析比较不同时间点iNOS和TNF-α蛋白的表达变化。以各泳道中iNOS、TNF-α与β-actin条带的光密度比值表示iNOS和TNF-α蛋白的相对表达量,然后按RT-PCR中的方法进行统计。结果:（1）RT-PCR:CPu和SNpc部位iNOS和TNF-αmRNA在MPTP注射6h和1d后表达均增高,其中1d是表达高峰,与Saline组相比差异有显著性（p<0.001）;3d后iNOS mRNA仍有表达,与Saline组相比差异有显著性（p<0.001）,然而TNF-αmRNA的表达与Saline组之间无明显差异存在（p>0.05）。FrA和VTA部位iNOS mRNA只在MPTP注射1d和3d后有显著性表达,而TNF-αmRNA的表达在MPTP注射后不同时间点与Saline组之间无明显差异存在（p>0.05）。（2）Western blot:CPu和SNpc部位iNOS和TNF-α蛋白在MPTP注射12h和1d后表达均增高,其中1d是表达高峰;3d后iNOS蛋白仍有表达,与Saline组相比有显著性差异（p<0.01）,而TNF-α蛋白的表达与Saline组之间无明显差异存在。FrA和VTA部位iNOS和TNF-α蛋白的表达只在MPTP注射1d后与Saline组有显著性差异,其余各时间点表达虽也有增高,但是与Saline组之间无明显差异存在（p>0.05）。结论:MPTP诱导的小鼠急性损伤PD模型中SNpc和CPu部位iNOS和TNF-α基因和蛋白在给药后多个时间点均有显著性表达,其中1d是表达高峰;VTA和FrA部位iNOS和TNF-α基因和蛋白的表达没有SNpc和CPu部位表达显著;表达增高的TNF-α和iNOS可能均对SNpc和VTA部位DA能神经元及CPu和FrA部位的DA能神经元末梢起了损伤作用,从而导致了DA能神经元的减少及其末梢退变的发生。

论文目录

• 英文缩写词表（Abbreviation）
• 中文摘要（Abstract in Chinese）
• 英文摘要（Abstract in English）
• 第一部分
• 引言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 第二部分
• 引言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 综述（Review）
• 综述参考文献（References of Review）
• 致谢（Acknowledgements）
• 已发表文章（Published Articles）