一个新的拟南芥微管结合蛋白——AtMAP18的功能分析

论文题目: 一个新的拟南芥微管结合蛋白——AtMAP18的功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 王霞

导师: 袁明

关键词: 微管结合蛋白,微管,微管列阵,细胞形态

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 微管在细胞分裂、分化,细胞形态决定及胞内物质运输等生理活动中起重要作用。植物有不同于动物的微管列阵,如周质微管列阵、早前期带和成膜体。在植物细胞的分裂、生长和发育过程中,微管列阵会依次转换。微管列阵的转换需要微管结合蛋白的参与。植物微管结合蛋白的研究是目前植物细胞骨架研究的前沿领域。 MAP1B是动物神经元细胞中的微管结合蛋白,用它的微管结合域的特征序列与拟南芥基因组比对,发现了一个功能未知的基因(At5g44610),其开放阅读框编码168个氨基酸,分子量为18.5 kDa,有8个类似MAP1B微管结合域的VVEKKN/EE不完全特征重复序列,因此推测其为一个微管结合蛋白。 我们通过克隆,原核表达,并纯化了该蛋白。通过共沉淀实验证明了它与微管结合。用绿色荧光染料Alex 488标记该蛋白,与红色荧光的罗丹明标记的微管蛋白在微管聚合缓冲液中共同孵育,结果显示它与体外聚合的微管共定位。证明这是一个新的微管结合蛋白,因此将它命名为AtMAP18。 激光共聚焦显微镜的观察结果表明AtMAP18虽然结合微管但是没有使微管形成微管束的效应。利用体外微管聚合系统的实验结果表明,AtMAP18对微管蛋白的聚合有影响,这种影响依赖于AtMAP18的浓度。低浓度的AtMAP18促进微管聚合,而高浓度的AtMAP18抑制微管聚合。但是,EDC交联实验表明AtMAP18不与微管蛋白单体结合。 为了研究AtMAP18的基因表达模式,构建了AtMAP18启动子-GUS质粒,并转化拟南芥植株。GUS活性检测结果显示:AtMAP18主要在根、花、果荚、子叶、下胚轴、表皮毛等器官和组织中表达。以原核表达的AtMAP18为抗原制备了抗AtMAP18抗体。Western blot实验也同样证明AtMAP18蛋白主要存在于拟南芥根和花等器官的组织中。 为了研究AtMAP18的生理功能,构建相应的质粒转化拟南芥,筛选获得AtMAP18过表达和RNAi转基因植株的纯合体株系。在RNAi转基因植株未发现明显的表型,但是在AtMAP18过表达的纯合体株系中,细胞发生了广泛的与细胞异向性生长相关的细胞形态异常:叶和子叶的铺板细胞、根的表皮细胞和根毛、下胚轴表皮细胞和皮层细胞与野生型同一部位的细胞相比,细胞形态都发生了改变;铺板细胞突起数明显减少,细胞边缘光滑;根和下胚轴表皮细胞肿胀;花粉形态异常,异常花粉没有内含物,不能正常萌发。 进一步对AtMAP18对细胞中微管骨架的作用进行了研究。免疫荧光双标记的观察结果表明拟南芥根的细胞中AtMAP18与细胞周质微管共定位。将AtMAP18连上红色荧光蛋白转化GFP-tubulin拟南芥,观察结果显示AtMAP18在子叶和下胚轴细胞中也与细胞周质微管共定位。对AtMAP18过表达植株中子叶铺板细胞微管和下胚轴表皮细胞微管观察显示,微管的排列即微管列阵与野生型的相比发生改变。AtMAP18过量表达使微管列阵的动态转换被抑制,导致细胞形态的改变。 本学位论文首先证明了AtMAP18是一个新发现的植物细胞微管结合蛋白,并对AtMAP18的生理功能进行了分析,证明了AtMAP18在对细胞微管骨架的组织和调控方面有作用,并进一步在植物细胞生长的调控和形态建成方面有重要的功能。

论文目录:

第一章 文献综述

1.1 微管骨架

1.1.1 微管的基本结构

1.1.2 微管蛋白

1.2 植物微管

1.2.1 植物细胞中微管生长的动态特征

1.2.2 植物细胞的微管列阵

1.3 植物微管结合蛋白

1.3.1 MOR1(Microtubule Organization1)和TMBP200

1.3.2 剑蛋白(Katanin)

1.3.3 SPR1(SPIRAL1)

1.3.4 EB1(End Binding1)

1.3.5 MAP65家族

1.3.6 磷脂酶D(PLD)和胁迫诱导的脂类信号

1.4 植物中微管骨架与细胞形态

第二章 拟南芥AtMAP18体外结合微管

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 原核表达菌株的转化与筛选

2.2.3 AtMAP18诱导表达与纯化

2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印记

2.2.5 猪脑微管蛋白的纯化及荧光标记

2.2.6 蛋白质浓度测定

2.2.7 蛋白质纯度鉴定

2.2.8 共沉淀实验

2.2.9 AtMAP18的荧光标记

2.3 结果与分析

2.3.1 AtMAP18基因的克隆和原核表达载体的构建

2.3.2 pGEX-4T-AtMAP18原核表达载体的鉴定

2.3.3 AtMAP18的核苷酸测定及氨基酸序列分析

2.3.4 AtMAP18蛋白的纯化

2.3.5 猪脑微管蛋白的纯化

2.3.6 AtMAP18体外结合微管

2.3.7 Alexa Fluor~R 488标记的AtMAP18结合微管的荧光观察

2.4 讨论

第三章 AtMAP18对微管聚合的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 浊度法

3.2.2 荧光镜观察AtMAP18对微管聚合的影响

3.2.3 EDC交联

3.2.4 超薄切片

3.3 结果与分析

3.3.1 AtMAP18对微管聚合的影响

3.3.2 AtMAP18影响微管聚合的荧光观察

3.3.3 AtMAP18不结合微管蛋白单体

3.3.4 荧光镜观察AtMAP18对微管成束的影响

3.3.5 电镜观察AtMAP18抑制微管聚合

3.4 讨论

第四章 AtMAP18的组织定位和亚细胞定位

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 AtMAP18抗体制备及纯化

4.2.2 拟南芥不同组织的免疫印记

4.2.3 拟南芥根的免疫荧光观察

4.2.4 AtMAP18启动子活性的组织特异性

4.2.5 pCAMBIA1300-RFP-AtMAP18转化野生型(Columbia ecotype)和GFP-α-tubulin拟南芥

4.3 结果分析

4.3.1 AtMAP18抗体纯化和效价检测

4.3.2 抗体分析AtMAP18在拟南芥的表达

4.3.3 AtMAP18启动子活性的组织特异性

4.3.4 AtMAP18的亚细胞定位

4.4 讨论

第五章 AtMAP18基因过表达和抑制植株的表型观察

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 RT-PCR检测AtMAP18基因过表达株系和抑制株系

5.2.3 Western blotting检测AtMAP18基因过表达株系和抑制株系

5.2.4 AtMAP18基因过表达株系和抑制株系纯合体的筛选

5.2.5 Spurr's树脂半薄切片

5.2.6 扫描电镜观察

5.3 结果与分析

5.3.1 转AtMAP18基因过表达和抑制纯合体的筛选

5.3.2 AtMAP18过表达和抑制的RT-PCR和Western blot鉴定

5.3.3 AtMAP18基因过表达和抑制株系的花粉观察

5.3.4 AtMAP18基因过表达和抑制株系根的观察

5.3.5 AtMAP18基因过表和抑制株系叶的观察

5.3.6 AtMAP18基因过表达和抑制子叶的观察

5.3.7 AtMAP18基因过表达下胚轴的观察

5.3.8 AtMAP18基因过表达表皮毛的观察

5.4 讨论

第六章 AtMAP18通过调控周质微管列阵参与细胞形态建成

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 野生型和AtMAP18过表达根的免疫荧光

6.2.3 AtMAP18过表达植株与GFP-Tubulin拟南芥植株杂交

6.2.4 Taxol处理GFP-Tubulin和AtMAP18过表达拟南芥

6.2.5 Orzalin处GFP-Tubulin和AtMAP18过表达拟南芥

6.3 结果与分析

6.3.1 AtMAP18过表达植株根的微管观察

6.3.2 AtMAP18过表达植株子叶和下胚轴的表皮细胞微管观察

6.3.3 Taxol处理后野生型和AtMAP18过表达子叶铺板细胞微管观察

6.3.4 Taxol处理后野生型和过表达下胚轴表皮细胞微管观察

6.3.5 Orzalin处理后野生型和过表达微管观察

6.4 讨论

第七章 结论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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