论文摘要
前言肿瘤是世界范围内的人类疾病，其发病率持续上升，严重威胁着人们的身心健康。因此，对肿瘤发病机制及诊断治疗的研究成为我国目前对肿瘤研究的一个重要课题。寻找肿瘤的治疗靶点是当前该领域研究的热点。其中对细胞信号转导通路关键蛋白作用分子机制的深入了解能使我们认识恶性肿瘤发生发展规律所在，在关键作用靶点进行阻遏，达到治疗肿瘤的目的，是近年来人们探寻治疗肿瘤的方向。p21活化激酶（p21-activated kinase，PAK）是一类进化上保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶（Rho-GTPase）Cdc42／Rac下游靶蛋白，参与许多重要细胞活动。到目前为止所发现的PAK家族共有6个成员，皆含有氨基末端（N-末端）调节区和羧基末端（C-末端）激酶区。根据其结构相似性可分为两类：Ⅰ类包括PAK1、PAK2与PAK3；Ⅱ类包括PAK4、PAK5与PAK6。PAK4蛋白是Ⅱ类PAK中发现最早，也是最早被作为Rho家族蛋白的下游分子。PAK4蛋白可以调控细胞内多种分子的磷酸化状态，在肿瘤的发展及侵袭转移过程中发挥重要作用。材料与方法1、实验材料（1）95例胃癌石蜡包埋标本取自中国医科大学第一附属医院胃癌研究室，手术时间2003～2005年，其中男性72例，女性23例，年龄29～80岁，平均年龄51岁。（2）40例新鲜胃癌组织及其相应癌旁非癌胃粘膜组织标本（距癌组织5cm以上），手术标本来源于本院肿瘤科手术患者，术中取组织液氮快速冷冻，-80℃冰箱保存。（3）人胃癌细胞系MKN45、AGS、SGC7901、MKN1、N87、BGC823、MGC803、永生化人胃粘膜上皮细胞系GES-1保存于中国医科大学细胞生物学实验室。2、实验方法（1）应用免疫组化SP方法检测95例人胃癌石蜡包埋标本中PAK4蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶免疫组织化学S-P方法。一抗PAK4（工作浓度1：50，BD，USA），S-P为福州迈新公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。同时PBS（0.01mol／L，pH7.4）代替一抗作为阴性对照。阳性结果判定：以肿瘤细胞的胞浆呈黄色者判定为阳性。先在低倍镜下对组织切片进行全面观察，随后于400倍光镜下随机选取5个视野，在每个视野下计数100个细胞，根据阳性细胞所占的比例，半定量将免疫染色分级如下：无明显阳性细胞的记为（-），＜25％的阳性细胞为（+），25～50％阳性细胞为（++），＞50阳性细胞（+++）。阳性表达率以（+）、（++）、（+++）占总例数的百分比表示。（2）应用蛋白印迹法检测40例新鲜人胃癌组织与癌旁非癌胃粘膜组织，人胃癌细胞系中PAK4蛋白表达情况。RIPA buffer 200μl裂解胃癌组织标本，采用Bradford法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏氟乙烯树脂（PVDF膜）转膜12小时，加入PAK4鼠抗人单克隆抗体（工作浓度1：2000，BD，USA）与GAPDH鼠抗人单克隆抗体（工作浓度1：10000，Sigma，USA），4℃下孵育12小时。辣根酶标记山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉生物技术公司产品），室温下孵育4小时，经ECL显色，暗室内X光底片曝光成像。采用Bandscan5.0软件测定蛋白条带的灰度值。实验结果（1）免疫组织化方法结果示95例人胃癌组织中，PAK4蛋白阳性染色64例，阳性率为67.37％。大部分阳性染色定位于细胞浆中（62／64，96.88％）；仅有极少数病例PAK4蛋白定位于细胞膜上（2／64，3.12％）。人胃癌组织中PAK4蛋白的表达与胃癌临床病理因素的关系：PAK4蛋白的阳性表达率与胃癌TNM分期（x2=10.426，P＜0.01）、淋巴结转移（x2=4.912，P＜0.05）有关。PAK4蛋白的阳性表达率与胃癌患者性别、年龄、组织分化程度、浸润深度、肝转移无关（P＞0.05）。（2）蛋白印迹法结果示40例胃癌患者癌组织及其癌旁非癌胃粘膜组织均有PAK4蛋白的表达。PAK4蛋白在癌组织表达量显著高于其配对的癌旁非癌胃粘膜组织（t=-5.978，P＜0.01）。PAK4蛋白在胃癌组织中的表达量随胃癌TNM分期进展逐渐增加，尤以Ⅳ期胃癌组织PAK4蛋白表达量最高，而PAK4蛋白在不同TNM分期下的癌旁非癌胃粘膜组织中表达无统计学差异。（3）蛋白印迹法结果示7种人胃癌细胞系中均有PAK4蛋白的表达，与永生化人胃粘膜上皮细胞系GES-1相比，PAK4蛋白在AGS、BGC823、MKN45、N87细胞系高表达，而MGC803、MKN-1、SGC7901细胞系低表达。结论PAK4蛋白的过度表达可能在人胃癌的发展及侵袭转移中发挥作用。
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