论文摘要
目的:建立稳定过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞系,研究S100A13基因过表达对甲状腺癌TT细胞生长及细胞周期的影响,探讨S100A13基因在甲状腺癌发生中的作用;将S100A13 shRNA入门质粒转染甲状腺癌TT细胞系,研究S100A13沉默对应激诱导FGF-1释放的影响。方法:应用Lipofectamine 2000将真核表达载体pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13和空载体pcDNA3.1/NT-GFP导入TT细胞系,经G418抗性筛选得到稳定的克隆并扩大培养成系,激光共聚焦显微镜观察外源性S100A13蛋白定位。采用Real Time PCR和Western Blot鉴定稳定表达S100A13的TT细胞系,应用细胞生长曲线、流式细胞术研究过表达S100A13基因对TT细胞生长速率和细胞周期的影响。将S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门质粒转染TT细胞,应用Real Time PCR法、间接免疫荧光法及Western Blot方法检测细胞内S100A13基因及蛋白表达的抑制效率,进一步应用间接免疫荧光,RT-PCR及ELISA检测S100A13沉默后无血清处理甲状腺癌TT细胞内FGF-1释放变化。结果:成功建立了稳定过表达S100A13和空载体的细胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP细胞组较TT-GFP和TT细胞组生长速度快[（2.30±0.24）×105vs.（1.40±0.25）×105和（1.50±0.22）×105,（P<0.05）];流式细胞仪结果显示TT-S100A13-GFP细胞组S期和G2/M期所占比例较TT-GFP和TT细胞组明显增高。[S期:（6.47±0.14）%vs.（5.86±0.23）%和（5.99±0.28）%,（P<0.05）,G2/M: （50.27±0.66）% vs.（39.39±0.23）%和（39.64±0.64）%,（P<0.05）]。S100A13-shR??ENTRTM/U6入门载体转染TT细胞后能够抑制S100A13基因及蛋白表达。应用间接免疫荧光、Real Time PCR及Western-blot方法检测S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体对S100A13靶基因的抑制效率约为50%,SR-PSOX shRNA干扰对S100A13基因无抑制作用。间接免疫荧光表明,S100A13 shRNA诱导S100A13沉默对正常培养的甲状腺癌TT细胞系的FGF-1的分布没有影响,FGF-1弥散分布于整个细胞;无血清处理后胞质中的FGF-1明显减少,但S100A13沉默的TT细胞胞质中FGF-1较TT细胞多。RT-PCR结果显示,S100A13沉默对正常培养的甲状腺癌TT细胞系的FGF-1的mRNA表达水平无影响,但无血清处理后S100A13沉默的TT细胞中FGF-1的表达较高。ELISA结果显示,S100A13 shRNA诱导S100A13沉默对正常培养上清中FGF-1的浓度无影响（P>0.05）;无血清处理后S100A13沉默的TT细胞培养上清中FGF-1的浓度较低（P<0.05）。结论:成功构建了稳定过表达S100A13基因的甲状腺癌TT细胞系,稳定过表达S100A13基因对TT细胞的生长有促进作用,外源性S100A13基因亚细胞定位于TT细胞胞质。内源性S100A13基因定位于TT细胞胞质。S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体能有效、特异性地抑制S100A13基因及蛋白表达。S100A13基因的抑制可以减弱FGF-1从细胞内释放到细胞外的过程。
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