KIAA0280在缺氧诱导神经元凋亡中的作用研究

论文摘要

大脑动脉阻塞引起的中风和脑梗死,因其在老年人中致残高和易引起智能缺陷,成为严重影响人们健康的世界性难题。随着人类寿命的延长,遭受这种疾病的患者数量将进一步增加。最近,人们对局部缺血引起脑损伤的分子生物学机制研究取得了突破性进展,在基础药理的动物实验中报道了很多具有很强的大脑保护作用、颇有治疗前景的药物。然而,目前,针对脑缺血性中风的治疗药物仍然有限。在近几年的实验研究中,人们相继阐明由谷氨酸、Ca2+、局部脑缺血的基因差异表达、凋亡引起的神经元死亡,脑局部缺血后的炎症反应等介导的缺血性神经元死亡机制。Kitagawa等于1990年报道了短暂缺血预处理能诱导缺血性耐受,产生神经保护作用。有鉴于此,我们课题组的臧林泉等人研究发现急性局灶性脑缺血大鼠缺血组织与非缺血组织中存在基因差异表达,克隆出与脑缺血相关的基因KIAA0280,其在急性局灶性脑缺血大鼠中明显上调表达,该基因的功能在国内外均未见报道,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。实验证实,缺血性神经元的死亡相当一部分是通过细胞凋亡的机制来实现。细胞凋亡过程涉及一系列基因和蛋白的表达,caspase,bcl-2等等,并在凋亡发生过程中会有新的物质来对凋亡作出调控。为此,我们研究KIAA0280在不同因素诱导神经元凋亡中的表达,将有助于明确其在凋亡中功能作用,为研究其在凋亡中的作用机制奠定基础,丰富细胞凋亡学说的内容,为临床治疗脑中风,心肌梗死,肾衰等与细胞凋亡相关的疾病提供新的治疗方法。目的通过建立原代神经元的体外培养技术和不同因素诱导的神经元凋亡模型;研究KIAA0280在不同因素诱导诱导神经元凋亡中表达情况;研究KIAA0280被特异性沉默后,基因的表达情况以及沉默KIAA0280后,对凋亡神经元的影响。方法（1）用原代分离、培养的方法,建立神经元的体外培养技术（2）将神经元放置于一密闭容器,然后抽真空,再充以95%N2,5%CO2,放入37℃培养箱中,分别缺氧不同时间,用Hoechst33258法,乳酸脱氢酶法, SRB法检测神经元的凋亡,建立缺氧诱导细胞凋亡模型（3）建立谷氨酸诱导神经元凋亡模型,用Hoechst33258法、乳酸脱氢酶法、SRB法检测神经元凋亡,建立脑缺血兴奋性氨基酸毒性细胞模型。（4）建立过氧化氢诱导神经元凋亡模型,用Hoechst33258法、乳酸脱氢酶法、SRB法检测神经元凋亡,建立脑缺血再灌注细胞模型（5）用RT-PCR特异性扩增出不同神经元凋亡模型中KIAA0280在神经元中的表达,观察不同因素引起的神经元凋亡中KIAA0280的表达变化。（6）用脂质体转染的方法,将KIAA0280基因特异性siRNA转染进神经元,观察转染前后神经元的生长变化,以及转染前后,凋亡神经元变化情况。结果（1）本实验成功建立原代神经元的体外培养技术,分离成功率高,神经元生长良好,存活率高,可存活30天以上。（2）用密闭容器抽真空的方法建立缺氧诱导神经元凋亡的模型。LDH,SRB的检测结果（P<0.05）表明本实验所建立细胞凋亡模型是成功的。RT-PCR结果表明在缺氧神经元中KIAA0280基因的表达明显上调,采用RNAi沉默KIAA0280的表达后,神经元的凋亡加重。（3）用谷氨酸诱导神经元凋亡,复制兴奋性氨基酸对神经系统的毒性作用细胞模型。结果显示,谷氨酸诱导神经元凋亡模型成功;RT-PCR结果显示,KIAA0280在谷氨酸诱导的凋亡神经元中没见明显表达,Hoechst33258和LDH结果显示,在转染KIAA0280特异性siRNA后,凋亡神经元的变化不明显。（4）用H2O2诱导神经元凋亡,复制脑缺血再灌氧自由基损伤的体外细胞模型。结果显示,H2O2诱导神经元凋亡模型成功;RT-PCR结果显示,KIAA0280在H2O2诱导的凋亡神经元中没有明显的表达,Hoechst33258和LDH结果显示,在转染KIAA0280特异性siRNA后,凋亡神经元的变化不明显。结论本实验成功建立原代神经元分离培养方法,建立不同因素诱导的神经元凋亡模型。从Hoechst33258、LDH、SRB以及RT-PCR结果,说明KIAA0280沉默后能促进缺氧引起的神经元凋亡,而在谷氨酸以及H2O2诱导的神经元凋亡模型中没有作用,提示KIAA0280跟缺氧诱导的神经元凋亡密切相关。

论文目录

中文摘要

英文摘要

第一章前言

1.1 脑中风的发病机制

1.2 脑缺血性损伤的细胞基础

1.3 缺血性脑损伤细胞凋亡的调控基因

1.3.1 热休克蛋白基因

1.3.2 Notch 基因

1.3.3 P38 与脑缺血细胞凋亡

1.3.4 Caspase 与神经元凋亡

1.3.5 Bcl-2 与神经元凋亡

1.3.6 C-myc 与神经元凋亡

1.3.7 P53 与神经元凋亡

1.3.8 造血细胞因子

1.3.9 CED 与神经元凋亡

1.3.10 Fas 与神经元凋亡

1.4 凋亡诱导因子与神经元凋亡

1.4.1 凋亡诱导因子

1.4.2 凋亡诱导因子诱导凋亡的机制

1.4.3 凋亡诱导因子对大脑神经元的凋亡作用

1.5 缺氧诱导因子与神经元凋亡

1.5.1 HIF-1

1.5.2 HIF-2

1.5.3 HIF-3

1.6 新的基因产物

1.7 基因功能研究的方法

1.7.1 反义技术

1.7.2 基因敲除和转基因技术

1.7.3 RNA 干扰

1.7.4 微阵列分析

1.7.5 基因诱捕技术

1.7.6 基因转导的方法

第二章神经元的体外培养

摘要

引言

2.1 材料与方法

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 仪器与材料

2.2 实验方法

2.2.1 神经元的分离

2.2.2 神经元培养

2.3 结果与讨论

2.3.1 神经元的形态学鉴定

2.3.2 神经元的Hoechst33258 荧光染色

第三章 KIAA0280 在缺氧诱导神经元凋亡中的作用

摘要

引言

3.1 材料与方法

3.1.1 实验动物

3.1.2 主要试剂

3.1.3 仪器与材料

3.2 实验方法

3.2.1 神经元的分离与培养

3.2.2 神经元体外缺氧模型的建立

3.2.3 神经元体外转染siRNA 模型的建立

3.2.4 设计KIAA0280 特异性PCR 引物

3.2.5 RT-PCR 判断KIAA0280 在缺氧诱导的凋亡神经元中的表达

3.3 统计学处理

3.4 结果与讨论

3.4.1 Hoechst33258 荧光染色法检测缺氧诱导的凋亡神经元

3.4.2 LDH 漏出检测缺氧诱导的凋亡神经元

3.4.3 SRB 法检测缺氧诱导的凋亡神经元

3.4.4 转染试剂对神经元的毒性作用

3.4.5 RT-PCR 检测KIAA0280 在缺氧诱导的凋亡神经元中的表达

3.4.6 转染KIAA0280 特异性siRNA 后神经元LDH 漏出结果

3.4.7 KIAA0280 被特异性沉默后对神经元的影响

第四章 KIAA0280 在谷氨酸诱导的神经元凋亡中的作用

摘要

引言

4.1 材料与方法

4.1.1 实验动物

4.1.2 主要试剂

4.1.3 仪器与材料

4.2 实验方法

4.2.1 神经元的分离与培养

4.2.2 谷氨酸诱导神经元凋亡模型的建立

4.2.3 RT-PCR 判断KIAA0280 在谷氨酸诱导凋亡神经元中的表达

4.3 统计学处理

4.4 结果与讨论

4.4.1 LDH 漏出检测谷氨酸诱导的凋亡神经元

4.4.2 SRB 法检测谷氨酸诱导的凋亡神经元

4.4.3 Hoechst33258 染色检测谷氨酸诱导的凋亡神经元

4.4.4 转染KIAA0280 特异性siRNA 后对凋亡神经元的影响

4.4.5 RT-PCR 检测KIAA0280 在谷氨酸诱导神经元凋亡中的表达

4.4.6 转染KIAA0280 特异性siRNA 后对凋亡神经元LDH 漏出的影响

2O₂诱导神经元凋亡中的作用'>第五章 KIAA0280 在H₂O₂诱导神经元凋亡中的作用

摘要

引言

5.1 材料与方法

5.1.1 实验动物

5.1.2 主要试剂

5.1.3 仪器与材料

5.2 实验方法

5.2.1 神经元的分离与培养

2O₂ 诱导神经元凋亡模型的建立'>5.2.2 H₂O₂诱导神经元凋亡模型的建立

2O₂ 诱导凋亡神经元中的表达'>5.2.3 RT-PCR 判断 KIAA0280 在 H₂O₂诱导凋亡神经元中的表达

5.3 统计学处理

5.4 结果与讨论

2O₂ 诱导的凋亡神经元'>5.4.1 LDH 漏出检测 H₂O₂诱导的凋亡神经元

2O₂ 诱导的凋亡神经元'>5.4.2 SRB 法检测 H₂O₂诱导的凋亡神经元

2O₂ 诱导的凋亡神经元'>5.4.3 Hoechst33258 染色检测 H₂O₂诱导的凋亡神经元

5.4.4 转染 KIAA0280 特异性 siRNA 后对凋亡神经元的影响

2O₂ 诱导神经元凋亡中的表达'>5.4.5 RT-PCR 检测 KIAA0280 在 H₂O₂诱导神经元凋亡中的表达

5.4.6 转染 KIAA0280 特异性 siRNA 后对凋亡神经元 LDH 漏出的影响

第六章总结与展望

总结

展望

参考文献

附录一攻读学位期间发表的文章

附录二缩写词中英文对照

致谢

KIAA0280在缺氧诱导神经元凋亡中的作用研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢