青霉T24-2木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

论文摘要

本实验室筛选到一株产纤维素酶和木聚糖酶菌株,青霉（Penicillium sp.） T24-2。液态发酵培养96h后,发酵液离心去除菌体和残渣,粗酶液采用（NH4）2S04分级沉淀、Sephadex G-25层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析、Sephadex G-200凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析等步骤,分离纯化出青霉T24-2中达到电泳纯的β-葡萄糖苷酶和2种木聚糖酶XYN-1,XYN-2。XYN-1被纯化了3.8倍,比活由37.5 U/mg上升到144.2 U/mg;XYN-2被纯化了5.4倍,比活由37.5U/mg上升到202.5U/mg;β-葡萄糖苷酶则被纯化20.6倍,比活由26.5 U/mg上升到546.7 U/mg。通过SDS-PAGE电泳测得木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶酶组分亚基的相对分子量分别为43.7kD,20.7kD和140.0kD。木聚糖酶XYN-1和XYN-2的最适反应pH分别为pH5.5,pH4.5,最适反应温度分别为70℃和50℃,最稳定的pH分别为pH4和pH5,两种木聚糖酶均在30℃-40℃下处理30 min后比较稳定。β-萄糖苷酶的最适反应pH为pH3.5,最适反应温度为70℃,最稳定的pH为pH4.5,在30℃～50℃之间比较稳定。在反应体系金属离子和化合物的终浓度均为5mmol/L条件下,ZnSO4和MgCl2对木聚糖酶XYN-1酶活有激活作用,而MgCl2则对XYN-2酶活有一定的抑制作用。MnSO4对木聚糖酶XYN-1酶活有强烈的抑制作用,但是对于XYN-2, MnSO4却起到了激活作用。SDS对两种木聚糖酶都有强烈的抑制作用。NiCl2和ZnSO4对β-葡萄糖苷酶酶活有激活作用,而FeSO4,MgCl2,MnSO4则对β-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用。实验过程中发现,对稻草粉不进行预处理和进行预处理两种情况下,青霉T24-2菌株液态发酵能够产生更高浓度的胞外蛋白。另外,该菌株能以尿素为氮源表达CMC酶活和木聚糖酶酶活,是一个优良的纤维素酶和木聚糖酶高产菌株,这是该菌株比较突出的两个特点,应在今后对其进一步的深入研究。本研究对青霉T24-2菌株所产3种胞外酶进行分离纯化并对其酶学性质进行了研究,为利用该菌株构建产纤维素酶和半纤维素酶的基因工程菌株打下基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 纤维素的结构
• 1.2 木聚糖的结构
• 1.3 纤维素酶产生菌和纤维素酶系的组成
• 1.4 木聚糖酶产生菌和木聚糖降解酶系的组成
• 1.5 β-葡萄糖苷酶的结构和功能
• 1.6 木聚糖酶的结构和功能
• 1.7 β-葡萄糖苷酶的应用
• 1.8 木聚糖酶的应用
• 1.9 本论文的研究内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂和分离介质
• 2.2 仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 菌体的培养
• 2.3.2 青霉 T24-2 粗酶液的制备
• 2.3.3 木聚糖酶XYN-1 的分离纯化
• 2.3.4 木聚糖酶 XYN-2 的纯化
• 2.3.5 β-葡萄糖苷酶的纯化
• 2.3.6 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶酶活的测定
• 2.3.7 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的一般理化性质
• 2.3.8 蛋白质浓度的测定
• 2.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和染色
• 2.3.10 蛋白分子量的测定
• 3 结果和分析
• 3.1 标准曲线的制作
• 3.1.1 木糖标准曲线
• 3.1.2 pNP 标准曲线
• 3.1.3 蛋白浓度标准曲线
• 3.1.4 标准蛋白分子量曲线
• 3.2 木聚糖酶 XYN-1的纯化
• 3.2.1 DE32离子交换柱层析
• 3.2.2 Sephadex G-200凝胶过滤层析
• 3.2.3 木聚糖酶XYN-1的分子量
• 3.3 木聚糖酶 XYN-2的纯化
• 3.3.1 Sephadex G-50凝胶过滤层析
• 3.3.2 木聚糖酶XYN-2的分子量
• 3.4 β-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 3.4.1 Sephadex G-75 凝胶过滤层析
• 3.4.2 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析
• 3.4.3 β-葡萄糖苷酶的分子量
• 3.5 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶理化性质分析
• 3.5.1 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最适反应pH
• 3.5.2 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最适反应温度
• 3.5.3 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的pH 稳定性
• 3.5.4 木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的温度稳定性
• 3.5.5 化合物对纤维素酶和木聚糖酶活性的影响
• 4 讨论和展望
• 参考文献
• 致谢