假单胞杆菌nahG和辣椒LOX基因克隆及其转化烟草研究

论文摘要

在自然界,植物在生长发育过程中常常受到各种逆境的胁迫。在植物与各种病原微生物的协同进化中,已经逐渐形成一系列复杂而有效的防御反应机制,包括植物细胞对逆境胁迫的感知、信号传导及防御反应相关基因的转录表达改变等环节。其中植物应答逆境信号传递受到了广泛的关注,现在已知SA、JA等植物内源激素参与了植物应答逆境的信号传递,但其作用机制还不是很清楚。为了研究茄科植物防御反应分子机制,剖析JA和SA等内源激素在不同下游防御反应中的调节作用及其可能机制,本研究选择脂氧合酶（LOX）和水杨酸羟基酶（nahG）作为靶标,分离了获得它们的部分或全长cDNA,构建了其表达载体并应用农杆菌介导的遗传转化方法获得了其相应的转基因烟草植株。主要结果如下:1、从辣椒UV照射处理的辣椒（Capsicum annuum L.）为材料构建的cDNA文库中分离获得LOX基因的阳性cDNA克隆,序列分析结果表明,该阳性克隆长度为285bp,含有95个氨基酸。其碱基序列和推定氨基酸序列与其他植物上已经分离和鉴定的LOX cDNA分别有92%和96%以上的同源性,推测该阳性克隆为辣椒LOX基因全长cDNA的部分序列。2、从nahG基因原核表达载体中获得nahG基因的全长cDNA,其长度为1305个碱基,含有435个氨基酸的开放读码框,其碱基序列和推定氨基酸序列均与其它微生物上已经分离和鉴定的nahG基因有92%以上的同源性,推测该阳性克隆为nahG基因的全长cDNA。3、分别构建上述LOX基因的RNAi载体和nahG基因的超表达载体,并进行测序验证。4、应用农杆菌介导的遗传转化方法,分别将上述两个载体通过遗传转化导入到烟草K326中,获得了转基因烟草T0代再生植株73株,其中54株为PCR阳性植株。RT-PCR显示,在LOX基因RNAi转基因烟草中的LOX基因的表达受到了抑制,nahG基因在nahG基因超表达转基因烟草中发生了转录表达。以上转基因植株的获得,为分析候选基因表达与JA和SA信号途径的关系奠定基础,也为进一步阐明候选基因的功能提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物抗病信号传递分子机制研究的重要意义
• 1.2 植物抗病分子机制研究进展
• 1.2.1 植物抗病反应
• 1.2.2 植物抗病反应中的信号分子
• 1.2.3 植物内源激素 SA、JA 介导的防御反应机制
• 1.3 RNA 干扰
• 1.4 本研究的内容和目标
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2. 水杨酸羟化酶和脂氧合酶基因的克隆方法
• 2.2.1 含部分attB 位点的引物的设计及PCR 产物扩增
• 2.2.2 nahG 和LOX 基因片段的扩增
• 2.2.3 两步PCR 法加attB 接头
• 2.2.4 gateway 位点特异性重组技术构建 LOX 基因 RNAi 载体和nahG 基因的超表达载体
• 2.2.5 植物表达载体转化农杆菌感受态细胞以及PCR 鉴定
• 农杆菌感受态制作和植物表达载体转化农杆菌感受态方法见附录
• 2.2.6 烟草的遗传转化
• 2.2.7 转基因苗的 PCR 检测
• 2.2.8 RT-PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 LOX 基因和nahG 基因的扩增
• 3.2 LOX 基因和nahG 基因的序列分析
• 3.3 入门载体的检测
• 3.4 LR 反应获得表达载体
• 3.5 农杆菌转化子的鉴定
• 3.6 转基因苗的分子检测
• 3.7 RT-PCR
• 4 讨论
• 4.1 载体构建
• 4.2 烟草的遗传转化
• 4.3 RNA 干扰
• 参考文献
• 附录
• 附录1 缩略词及英汉对照
• 附录2 主要实验仪器和试剂盒
• 附录3 所用试剂与缓冲液的配制
• 附录4 培养基的配方
• 附录5:试验中所用到的质粒图谱
• 附录6 大肠杆菌细胞感受态的制备及转化
• 附录7：根癌农杆菌感受态细胞制备及质粒转化
• 附录8：烟草总RNA 提取见附录
• 附录9：本研究中所用的 DNA Marker
• 附录10:烟草遗传转化过程
• 致谢