蛋白酶高产菌株的选育及酶学性质研究

论文摘要

从新乡市周边郊区的蔬菜大棚、奶牛养殖场、养鸡场、养猪场、豆制品加工厂、鱼塘沉积的污泥以及埋死鱼的土壤、倾倒豆渣的土壤等8处蛋白质含量较高的土壤中分离得到了一株高产蛋白酶性质优良的菌株N1,对其产酶的酶学性质进行研究,试验结果表明,紫外线诱变之前该蛋白酶最适作用温度为60℃,最适作用pH为8,在pH为6时也具有较高酶活性,在pH为6时酶活力为1020U/ml,在pH为8时酶活为1998U/ml。通过紫外线照射处理对菌株进行人工诱变,结果表明在紫外线照射处理30s时,菌株致死率达到92%,此时正突变率较高,诱变效果较好。诱变后在pH为6时酶活力为3398U/ml,提高了249%;在pH为8时酶活力为2406U/ml,提高了21%。通过5次传代,测定酶活力结果显示该诱变后菌株产酶的酶活力变化不大,具有较好的稳定性。通过对菌株的菌落及菌体特征鉴定、16S rRNA的序列分析,判断该菌株为黄杆菌,并进行聚类分析显示其种属同源性。通过SDS-PAGE电泳测定该蛋白酶的分子量为25000Da左右。通过本研究,从土壤中获得的一株黄杆菌属菌株,经过人工诱变之后使该菌株产生的蛋白酶活力提高了近3倍,产生的蛋白酶具有较好的热稳定性、较广泛的pH适应范围以及较高蛋白酶活性,为蛋白酶的工业生产提供了一个优良菌株,该菌株可以作为蛋白酶高产菌株应用于饲料、洗涤剂等工业生产中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 蛋白酶的分类、应用及研究现状
• 1.1.1 酸性蛋白酶
• 1.1.2 中性蛋白酶
• 1.1.3 碱性蛋白酶
• 1.2 人工诱变技术
• 1.2.1 物理诱变
• 1.2.2 化学诱变
• 1.2.3 生物处理
• 1.2.4 复合诱变
• 1.2.5 人工诱变技术在微生物育种中的研究概况
• 1.3 种属鉴定
• 1.3.1 植物鉴定方法
• 1.3.2 动物鉴定方法
• 1.3.3 传统的菌种鉴定方法
• 1.3.4 分子生物学鉴定方法及研究概况
• 1.4 蛋白酶分子量的测定
• 1.4.1 化学组成法测定
• 1.4.2 凝胶过滤法
• 1.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.4.4 沉降法（超速离心法）
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 本实验常用配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种初筛
• 2.2.2 菌种复筛
• 2.2.3 蛋白酶活力测定
• 2.2.4 酶学性质测定
• 2.2.5 诱变选育
• 2.2.6 菌株DNA 的制备
• 2.2.7 菌株基因组16S PCR
• 2.2.8 PCR 产物的回收
• 2.2.9 扩增产物的克隆
• 2.2.10 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.2.11 16S 基因的序列分析
• 2.2.12 蛋白酶分子量测定
• 2.2.13 诱变菌株的遗传稳定性测定
• 3 结果
• 3.1 菌种的分离筛选
• 3.2 蛋白酶活力测定
• 3.2.1 蛋白酶活力标准曲线
• 3.2.2 蛋白酶活力及酶学性质测定结果
• 3.3 菌株诱变结果
• 3.3.1 紫外线照射致死率
• 3.3.2 紫外线诱变结果
• 3.4 基因组DNA 的提取
• 3.5 基因组 16S PCR 扩增
• 3.6 16S rRNA 阳性克隆的测序
• 3.7 筛选菌株聚类分析
• 3.8 蛋白酶分子量测定
• 3.9 遗传稳定性测定
• 4 讨论
• 4.1 培养条件
• 4.2 透明圈
• 4.3 菌种的诱变
• 4.4 发酵条件及酶学性质
• 4.5 菌种鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果