首页> 正文

血管内皮细胞microRNA的表达谱分析和功能研究

2020-12-11阅读(865)

血管内皮细胞microRNA的表达谱分析和功能研究

论文摘要

研究背景和目的随着人类基因组计划的完成,生命科学进入了后基因组时代。研究表明,编码蛋白的基因总数不到3万个,远远少于最初预计的10万个左右。动植物基因组的非蛋白质编码区存在大量非编码RNA基因,约占整个基因组的98%,如此庞大的区域担负着基因的表达调控等重要功能。近年来发现的非编码小RNA主要包括小干扰RNA（small interfering RNAs, siRNAs）、微RNA（microRNAs, miRNAs）、重复关联小RNA（repeat associated small interfering RNAs, rasiRNAs）和piwi交互RNA（piwi - interacting RNAs, piRNAs）。目前人们对非编码RNA,尤其是microRNA在心血管、肿瘤、干细胞等领域的研究取得了长足的进步,极大的丰富和拓展了人们对这些重要生命科学领域的认知。本课题旨在选择血管内皮细胞高表达的microRNA对其进行相关表达谱分析和功能研究,探寻microRNA可能参与的心血管相关病理生理过程,进一步阐明诸如动脉粥样硬化、肿瘤血管生成等的发病机制,为今后运用RNA干扰治疗心血管疾病提供新的靶点。研究方法提取人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vascular Endothelial Cell, HUVEC）的总RNA,变性胶富集大小约19-25个核苷酸大小的RNA后在3’和5’端分别连接合适的连接子,经过RT-PCR反应扩增后进行T-A克隆,重组质粒送商业测序,最终构建HUVEC的miRNA文库。运用Northern Blot检测文库中miRNA的表达谱:15%变性胶分离总RNA,电转移至尼龙膜,紫外线交联后运用γ32P-ATP标记的寡核苷酸探针进行杂交,然后运用X胶片-80℃显影。运用实时荧光定量RT-PCR检测miRNA在组织和细胞系中的相对表达量。将包含miR-126基因的EGFL7的第7个内含子连同相邻的外显子克隆至pEGFPc1质粒并转染293T细胞进行表达,运用PCR和Northern Blot检测转录产物以确定miR-126的生物来源和成熟机制。运用生物信息学工具PicTar、TagetScan5.1、miRanda、miRBase预测miRNA的靶基因。将预测靶基因的3’UTR克隆入pGL3-control的XbaI位点构建萤光素酶报告基因,与miRNA mimics和对照mimics共转染293T细胞,通过分析萤光素酶的表达量以初步筛选这些内皮高表达miRNA的靶基因。进一步通过Western Blot在细胞中确认miRNA对其靶基因的调控关系。干预HUVEC中miR-155或miR-221/222的表达,血管紧张素（Angiotensin, Ang）II刺激HUVEC后运用BCECF-AM标记的Jurkat T细胞检测HUVEC与单个核细胞的黏附性。采用细胞划痕法检测miRNA对AngII刺激下HUVEC迁移的影响。数据统计分析:两组间数据比较采用student t检验,多组间数据比较采用ANOVA方差分析,P<0.05代表结果存在统计学意义。研究结果成功建立了HUVEC的microRNA文库,发现miR-26a, miR-26b, miR-126, miR-155等在文库中的克隆数目相对较多。Northern Blot结果确认miR-126, miR-155和miR-221在HUVEC中高表达。其中miR-126在小鼠各器官组织中普遍表达并且在心脏和肺组织中高表达,然而在细胞水平,miR-126特异表达于内皮细胞而在人冠状动脉平滑肌细胞（Human Coronary Artery Smooth Muscle Cell,HCASMC）以及293T、Hela、小鼠胚胎成纤维细胞中均无表达。miR-155, miR-221和miR-222在血管平滑肌细胞也呈高表达但在Jurkat T, HEK293和Hela细胞中表达丰度很低或检测不出。miR-126前体序列和基因组位置在人、大鼠和小鼠基因组中保守。miR-126基因位于EGFL7的第7个内含子中,Real-Time PCR显示EGFL7与miR-126有着相似的表达谱。包含miR-126基因的内含子在工具细胞中能够被识别并剪切修饰形成成熟的具有功能的miR-126,而其宿主基因EGFL7也能够拼接形成mRNA,两者的成熟和表达互不影响。生物信息学预测结果表明,VEGF, RGS3, v-CRK, PIK3R2和EGFL7的3’UTR与miR-126的5’端“种子序列”有较佳的匹配位点。萤光素酶报告基因筛选和Western Blot结果显示,VEGF和PIK3R2是miR-126共同的靶基因。进一步,在MCF-7细胞中过表达miR-126可以通过对VEGF和PIK3R2的调控而降低AKT磷酸化水平。此外,miR-126在乳腺癌组织中表达明显下调而VEGF, PIK3R2的表达量以及AKT磷酸化水平均有明显升高。生物信息学分析表明ETS-1的3’UTR区存在多个miR-155和miR-221/222可能同时调控的靶点。萤光素酶报告基因和Western Blot结果证实miR-155和miR-221/222能够同时调控靶基因ETS-1的表达。miR-155还能调控AngII的1型受体在蛋白水平的表达。AngII能够刺激HUVEC上调转录因子ETS-1及其下游基因VCAM1, ICAM1, MCP1和FLT1 mRNA等的表达,同时还能增强HUVEC与Jurkat T细胞的粘附作用以及HUVEC的迁移活性。然而在HUVEC中过表达miR-155或miR-221/222并以AngII刺激后,与对照相比,转录因子ETS-1及其下游基因VCAM1, MCP1和FLT1 mRNA等的表达均有不同程度的逆转,ICAM1 mRNA无明显变化。同时,过表达miR-155或miR-221/222的HUVEC对Jurkat T细胞的粘附作用明显降低。此外,过表达miR-155还能降低AngII诱导的HUVEC迁移活性,而miR-221/222无此作用。研究结论（1）成功建立了HUVEC的miRNA文库,确认miR-126在HUVEC特异表达,miR-155,miR-221/222在HUVEC高表达。（2） miR-126来源于EGFL7基因的第7个内含子并且miR-126与其宿主基因的成熟和修饰互不干扰。VEGF和PIK3R2均为miR-126的靶基因。在MCF-7细胞系中,miR-126能够降低VEGF/PI3K/AKT通路的活性。在乳腺癌组织中,miR-126的表达降低而VEGF,PIK3R2的表达以及AKT磷酸化水平均明显升高。（3） ETS-1是miR-155和miR-221/222共同的靶基因。miR-155还能够调控AT1R基因的表达。miR-155和miR-221/222均能通过调控ETS-1及其下游基因的表达而减轻AngII诱导的内皮细胞炎症反应。同时miR-155还能够抑制AngII诱导的内皮细胞迁移活性。（4）一个miRNA可能具有两个或两个以上靶基因而一个基因也有可能受两个或两个以上miRNA的调控。（5）内皮细胞高表达miRNA在血管炎症反应、动脉粥样硬化以及肿瘤血管新生等疾病的发生、发展过程中可能起重要的调控作用。miRNA有望为这些疾病提供新的治疗靶点和治疗手段。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略词表
  • 前言
  • 第一部分人脐静脉内皮细胞microRNA 文库的构建和表达谱分析
  • 研究背景
  • 实验材料
  • 主要试剂配制
  • 主要仪器设备
  • 实验方法
  • 1. 细胞的培养及传代
  • 2. 小鼠组织的获取和保存
  • 3. 样品总RNA 的提取
  • 4. M icroRNA 文库的构建
  • 5. N orthern Blot 检测小鼠组织及人细胞系中的microRNA 表达谱结果
  • 结果
  • 1. 人脐静脉内皮细胞microRNA cDNA 文库
  • 2. m iRNA 的组织和细胞表达谱
  • 讨论
  • 小结
  • 第二部分miR-126 的成熟机制及其对VEGF/P13K/AKT 通路的调控
  • 研究背景
  • 实验材料
  • 主要仪器设备
  • 实验方法
  • 1. R eal-Time PCR 检测miR-126 和EGFL7 的组织和细胞表达谱
  • 2. m iR-126 的成熟机制
  • 3. 细胞转染
  • 4. W estern Blot
  • 5. 靶基因预测
  • 6. 基因3’UTR-PGL3 质粒的构建和定点突变
  • 7. 萤火虫萤光素酶检测miR-126 对靶基因的作用
  • 8. 统计学分析
  • 结果
  • 1. m iR-126 位于哺乳动物EGFL7 基因的内含子中并且序列高度保守
  • 2. m iR-126 和EGFL7 基因的表达谱相关性
  • 3. m iR-126 及其宿主基因的形成机制和表达的相互影响
  • 4. miR-126 的靶基因预测及其对 VEGF/PI3K/AKT 通路的调控
  • 5. miR-126 在人乳腺癌组织中表达下降
  • 讨论
  • 小结
  • 第三部分 miR-155 和 miR-221/222 在调控 AngII 诱导的内皮细胞炎症和迁移的中作用及 机制
  • 研究背景
  • 实验材料
  • 主要仪器设备
  • 实验方法
  • 1. 生物信息学预测mir-155 和miR-221/222 的靶基因
  • 2. 双萤光素酶报告基因验证miR-155 和miR-221/222 的靶基因
  • 3. 实时荧光定量PCR 检测miRNA 和基因的表达
  • 4. W estern Blot
  • 5. 细胞粘附实验
  • 6. 细胞迁移实验
  • 7. 统计学分析
  • 结果
  • 1. 生物信息学提示ETS-1 是miR-155 和miR-221/222 共同的靶基因
  • 2. 双萤光素酶报告基因证实ETS-1 是miR-155 和miR-221
  • 3. 干预HUVEC 中miR-155，miR-221 和miR-222 的表达
  • 4. m iR-155 和miR-221/222 对HUVEC 中ETS-1 的调控
  • 5. miR-155和 miR-221/222能够降低AngII诱导的VCAM1,MCP1,FLT1 和 ETS-1 mRNA 的表达
  • 6. miR-155,miR-221/222 和 si-ETS1 均能减轻 AngII 诱导的内皮细胞炎 症反应
  • 7. m iR-155 抑制AngII 诱导的HUVEC 迁移
  • 讨论
  • 小结
  • 总结
  • 参考文献
  • 文献综述
  • 参考文献
  • 发表论文及参加科研项目
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].藏鸡不同发育阶段腿部肌肉组织转录组及microRNA联合分析[J]. 畜牧兽医学报 2019(12)
    • [2].microRNA在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展[J]. 西部医学 2020(01)
    • [3].microRNA在神经病理性疼痛中的研究与进展[J]. 中国疼痛医学杂志 2020(01)
    • [4].胃癌相关性microRNA的研究进展[J]. 医学理论与实践 2020(03)
    • [5].MicroRNA在乳腺癌耐药中的功能研究进展[J]. 中国医药导报 2020(02)
    • [6].MicroRNA在血吸虫病致病机制中的作用[J]. 中国社区医师 2019(30)
    • [7].信号通路相关的microRNA在骨肉瘤中的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志 2019(06)
    • [8].家兔中microRNA的研究进展[J]. 浙江农业学报 2020(01)
    • [9].炎症相关microRNA在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展[J]. 临床急诊杂志 2020(02)
    • [10].microRNA在非酒精性脂肪性肝病中的研究进展[J]. 中国医学创新 2020(02)
    • [11].microRNA在狼疮性肾炎发病机制中的研究进展[J]. 右江医学 2020(01)
    • [12].高原肺水肿大鼠肺组织差异表达microRNA的筛选、生物学功能分析及验证[J]. 山东医药 2020(06)
    • [13].MicroRNA与炎症性肠病[J]. 实用医学杂志 2020(01)
    • [14].microRNA调控间充质干细胞成骨分化的研究进展[J]. 同济大学学报(医学版) 2020(01)
    • [15].MicroRNA在糖尿病足溃疡中的调控机制和治疗前景[J]. 生命科学 2020(02)
    • [16].外周血microRNA在评估头颈部鳞状细胞癌淋巴结转移中的研究进展[J]. 中国眼耳鼻喉科杂志 2020(02)
    • [17].microRNA对干细胞调控作用的研究进展[J]. 中国老年学杂志 2020(08)
    • [18].卵泡液中细胞外囊泡及其携带的microRNA对卵泡发育的作用[J]. 生物工程学报 2020(04)
    • [19].血清microRNA诊断甲状腺乳头状癌的研究进展[J]. 泰山医学院学报 2020(04)
    • [20].microRNA参与柑橘生长发育和抗逆的研究进展[J]. 园艺学报 2020(05)
    • [21].MicroRNA与乳腺癌干细胞的研究进展[J]. 现代肿瘤医学 2020(13)
    • [22].microRNA在二叶式主动脉瓣畸形机制中的研究进展[J]. 现代医学与健康研究电子杂志 2020(02)
    • [23].microRNA在白癜风发病机制中的研究进展[J]. 医学综述 2020(10)
    • [24].MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的研究进展[J]. 口腔颌面外科杂志 2020(03)
    • [25].慢性原发免疫性血小板减少症患者血小板microRNA差异表达的研究[J]. 中国医药科学 2020(10)
    • [26].microRNA与药物性肝损伤[J]. 中国临床药理学与治疗学 2020(07)
    • [27].Dysregulation of microRNA in cholangiocarcinoma identified through a meta-analysis of microRNA profiling[J]. World Journal of Gastroenterology 2020(29)
    • [28].microRNA调节小胶质细胞功能参与病理性疼痛的研究进展[J]. 神经解剖学杂志 2020(03)
    • [29].microRNA在精子发生中的作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2020(08)
    • [30].MicroRNA在神经管畸形中的研究进展[J]. 生命的化学 2020(07)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    血管内皮细胞microRNA的表达谱分析和功能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5