神经肽Y和miRNA在垂体瘤细胞中的作用及相关性

论文摘要

目的本实验通过应用小分子干扰RNA （siRNA）技术、化学合成反义核酸分子、构建质粒,干扰垂体瘤细胞的NPY表达及调节miR-15a/-16-1,为探讨NPY和miRNA-15a及miRNA-16-1在人垂体瘤细胞中的表达及其在垂体瘤发生、发展过程中可能存在的相互调节关系,探寻治疗垂体瘤的新靶点,拓展一条治疗垂体腺瘤的新方法。方法细胞实验部分：垂体瘤细胞分组：A组、空白对照,B组、NPY增强剂,C组、NPY拮抗剂,D组、NPY特异性siRNA转染垂体瘤细胞,E组、化学合成针对miRNA-15a反义核酸分子转染垂体瘤细胞,F组、携带miRNA-15a质粒转染垂体瘤细胞,G组、化学合成针对miRNA-16-1反义核酸分子转染垂体瘤细胞,H组、携带miRNA-16-1质粒转染垂体瘤细胞。应用神经肽Y拮抗剂、增强剂,同时设计NPY特异性小分子干扰RNA转染垂体瘤细胞,细胞培养48小时后,分别应用实时荧光定量PCR检测垂体瘤细胞中NPY mRNA水平和western blot方法检测细胞内蛋白表达量的变化,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞技术检测垂体瘤细胞周期和凋亡。通过化学合成反义核酸分子及质粒转染垂体瘤细胞,细胞培养48小时后,分别应用荧光定量PCR方法检测细胞核中niR-15a/-16-1 mRNA表达水平,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞技术测定垂体瘤细胞周期分布。干扰垂体瘤细胞中NPY,同时分别检测miR-15a/-16-1变化,通过上调及下调垂体瘤细胞中miR-15a/-16-1后,检测NPY的变化,并对NPY及miR-15a/-16-1进行相关性统计学分析,探讨二者之间可能存在的相关关系。垂体瘤组织实验部分：收集天津医科大学总医院神经外科垂体瘤病例30例,术前已通过临床、内分泌检验、影像学确诊,并经手术及术后病理证实。标本共分两组,不同病理类型垂体瘤组织的标本30例为A组,其中包括生长激素腺瘤、泌乳素腺瘤、促肾上腺皮质激素腺瘤、无功能垂体腺瘤。垂体组织（垂体瘤周边的残余正常垂体）30例为B组。分别进行NPY、miR-15a/-16-1的检测,比较正常垂体组织与垂体瘤组织中NPY及miR-15a/-16-1表达的差异。结果垂体瘤细胞实验结果：各实验组垂体瘤细胞在给予神经肽Y拮抗剂、增强剂、同时设计NPY特异性小分子干扰RNA转染垂体瘤细胞、应用质粒和反义核酸,上调、下调：niRNA-15a/-16-1,等相应处理48小时后,进行实时荧光定量PCR和Western blot、MTT、细胞生长曲线及流式细胞术等方法进行检测。给予上述不同因素处理48小时后,采用实时荧光定量PCR检测各组垂体瘤细胞中的NPY基因表达如下：C、D、F、H组分别与A组相比较,NPY mRNA基因表达降低,2-ΔΔCT值<1,其差异有统计学意义,分别P<0.05；B、E、G组分别与A组相比较,NPY mRNA基因表达升高,2-ΔΔCT值<1,其差异均有统计学意义,分别P＜0.05。Western blot检测垂体瘤细胞中NPY蛋白的表达,各实验组垂体瘤细胞中的NPY蛋白表达如下：C、D、F、H组分别与A组相比较NPY蛋白表达降低,其差异均有统计学意义,分别P＜0.05; B、E、G组与A组相比NPY蛋白表达升高,其差异均有统计学意义,分别P<0.05。细胞生长曲线图显示各组垂体瘤细胞的增殖能力：C、D、F、H组分别与A组相比较明显降低,其差异均有统计学意义,分别P<0.05；B、E、G组分别与A组相比细胞增殖能力增高,其差异均有统计学意义,分别P<0.05。流式细胞技术检测结果显示：C、D、F、H组分别与A组相比S期细胞明显降低,GO/G1期细胞数明显升高,各组间差异均有统计学意义,分别P<0.05,M期细胞无明显变化；B、E、G组分别与A组相比S期细胞明显升高,GO/G1期细胞数明显降低,各组间差异均有统计学意义,分别P<0.05,M期细胞无明显变化。垂体瘤组织实验结果：RT-PCR检测NPY、miR-15a/-16-1在各垂体瘤组织分组中的基因表达,NPY在垂体瘤组织中较正常垂体组织中呈高表达,垂体腺瘤中miRNA-15a和miRNA-16-1的表达与正常垂体组织相比明显下调。两组间差异有统计学意义,分别P<0.05。结论使用NPY拮抗剂及siRNA沉默NPY的基因表达后,垂体瘤细胞生长速度缓慢,且部分细胞出现凋亡；使用NPY增强剂后,增强了垂体瘤细胞内NPY表达,垂体瘤细胞增殖也明显。调节人垂体瘤细胞miR-15a/-16-1表达后,垂体瘤的细胞生长受到影响,下调miRNA-15a/-16-1表达,垂体瘤细胞增殖明显；上调miRNA-15a/-16-1的表达,垂体瘤细胞生长受到抑制。给予人垂体瘤细胞增强和拮抗NPY后,检测niRNA-15a/-16-1的表达,结果显示增强NPY表达时,miRNA-15a/-16-1表达水平下调；拮抗NPY表达时,miRNA-15a/-16-1水平上调,NPY与miRNA-15a/-16-1呈负相关关系。通过调节人垂体瘤细胞miRNA-15a/-16-1后,检测NPY的表达,当上调miRNA-15a/-16-1时,NPY表达降低；下调miRNA-15a/-16-1时,NPY表达增强。两者NPY与miRNA-15a/-16-1呈负相关关系。垂体瘤组织中检测NPY及miR-15a/-16-1,与正常垂体组织中表达不同。垂体瘤组织中NPY表达较正常垂体组织中NPY表达增强。垂体瘤组织中miR-15a/-16-1表达较正常垂体组织中miR-15a/-16-1表达降低。本实验为临床基因治疗垂体瘤疾病提供实验依据和新的治疗思路。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状
• 研究目的、方法
• 一、垂体瘤细胞实验部分
• 1. 材料和方法
• 1.1 主要试剂及材料
• 1.2. 主要仪器
• 1.3 垂体瘤细胞的传代、培养
• 1.4 垂体瘤细胞分组
• 1.5 siRNA、化学合成反义核酸、质粒,转染垂体瘤细胞
• 1.6 检测指标及检测方法
• 1.6.1 检测指标垂体瘤细胞中NPY、miRNA-15a、miRNA-16-1
• 1.6.2. 荧光定量PCR
• 1.6.3 Westem blot检测NPY蛋白的表达
• 1.6.4 细胞生长曲线测定
• 1.6.5 MTT法检测细胞增殖
• 1.6.6 流式细胞仪检测细胞周期
• 1.7. 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 垂体瘤细胞观察
• 2.2 检测垂体瘤细胞的NPY基因表达
• 2.3 检测垂体瘤细胞的NPY蛋白表达
• 2.4 检测垂体瘤细胞miRNA-15a/-16-1的基因表达
• 2.5 垂体瘤细胞生长曲线
• 2.6 MTT方法检测垂体瘤细胞的增殖活性
• 2.7 流式细胞术测定细胞周期分布
• 3. 小结
• 二、垂体瘤组织实验
• 1 临床资料和方法
• 1.1 一般资料和试剂
• 1.1.1 一般临床资料
• 1.1.2 分子生物学试剂
• 1.1.3 免疫荧光化学试剂
• 1.2. 垂体瘤组织标本分组
• 1.3 检测指标及方法
• 1.3.1 检测垂体瘤组织中NPY和m iRNA-15a及m iRNA-16-1的表达
• 1.3.2. 基因表达
• 1.4 数据处理方法
• 1.5 统计学分析处理
• 2 结果
• 2.1 临床资料
• 2.1.1 典型病例
• 2.1.2 病理诊断
• 2.2 RT-PCR检测结果
• 2.3 Western-blot检测标本NPY的蛋白表达
• 3. 小结
• 三、讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢