论文摘要
人类免疫缺陷病毒（HIV）的膜蛋白（Env）位于病毒的表面，是中和抗体作用的主要靶位，但野生型Env在机体免疫压力下易发生免疫逃逸，这可能与其复杂的构象和表面寡糖链有关。本课题试图通过删除寡糖链、复杂氨基酸侧链及高变区，来暴露目前已知的及CD4i（CD4 induced）区潜在的中和抗体表位，以期诱导广谱有效的中和抗体，同时将体液免疫与细胞免疫结合起来，力图寻找一种能够诱导均衡、有效的体液和细胞免疫反应的免疫原。本课题根据HIV-1 Env三维结构中四种广谱中和单抗的结合表位及前人经验，设计四组突变，通过四组之间不同搭配设计五种突变组合：M2、M5-1、M5-2、M4和M7。在原始株及各突变组合的基础上做V1V2区的删除，设计另六种突变组合：dWt、dM2、dM5-1、dM5-2、dM4和dM7。通过环形诱变，DpnI筛选的方式得到这11种突变体，酶切初步鉴定，测序确定突变结果。提取原始及突变质粒并转染293T细胞，经WesternBlot检测体外表达情况。原始及突变质粒免疫家兔，用五个不同厂家ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体水平，用假病毒单周期感染中和试验检测其中和抗体水平，将ELISA抗体检测结果与中和试验检测结果做相关性分析。原始及突变质粒免疫小鼠，取血分离血清，检测中和抗体水平；取脾分离脾白细胞，以SHIVchn19肽库和单肽Env34作为刺激物，用IFN—γELISPOT方法评价细胞免疫反应。将原始及改造后env基因克隆入pcDNATM3.1 D／V5-His-TOPO（?）载体，WB检测体外表达情况，与pSG3△Env共转染293T细胞，收集上清感染TZM-bl细胞，检测改造对功能性假病毒形成的影响。WB结果显示D-GPEi的原始株及各突变克隆，以及克隆入pcDNATM3.1 D／V5-His-TOPO（?）载体的原始及突变env在体外都能正常表达，且表达量没有明显区别，突变株的Env条带较原始株泳动速率提高，进一步佐证了改造结果。家兔血清ELISA检测结果表明，电穿孔介导DNA免疫家兔，与单纯DNA免疫相比，其所用质粒量少，免疫周期短，抗体水平高。不同厂家抗体检测试剂盒检测家兔四次免疫后血清中抗体水平，检测的结果数值上虽然存在差异，但总体的趋势相似。Wt、N2010、G2、M2、M5-1和dM5-1组抗体水平较高，但各组与Wt组比较没有明显优势。对于同一质粒免疫的两只家兔，其抗体水平不一致。中和试验结果显示，Wt、N2010、G2、M2和dM2中和抗体水平较高，但同一组两只家兔中和抗体水平不一致。将ELISA抗体检测结果与假病毒中和试验检测结果，做相关性分析，两者之间没有统计学意义上的相关性，但对于同一组两只家兔，其中和抗体水平高的总抗体水平也高。小鼠ELISPOT结果显示，与原始组相比，改造组细胞免疫反应大部分是降低的，包括M5-1、dM5-1、M5-2、dM5-2、M7、dM7、dWt、M4和dM4，其中与Wt组相比降低有统计学意义（p＜0.05）的包括dM5-1、M5-2、M7、dM7和dM4，其余各组与Wt组相比虽有降低但无统计学意义。改造组M2、dM2、G2与Wt组相比细胞免疫反应增高，其中M2组的增高有统计学意义（p＜0.05）。针对四个肽库的细胞免疫反应由强到弱：肽库1＞肽库3＞肽库2＞肽库4，肽库1在四肽库总反应中所占比例最高，＞75％。各肽库反应与总反应的相关性由高到低肽库1＞肽库3＞肽库2＞肽库4，针对Env34的细胞免疫反应与总反应有较高的相关性，相关系数为0.942（p＜0.01）。在Wt和74-2两假病毒中和试验中，dWt、M2、M5-2、M5-1、dM7、N201Q组与Wt组相比，其中和抗体水平有增高趋势，只有dWt组和M5-2组的增高在两假病毒试验中都有有统计学意义（p＜0.05），此外，在Wt假病毒中和试验中，M5-1组的增高有统计学意义，在74-2假病毒中和试验中，M2和N2010组的增高有统计学意义。从两假病毒中和试验结果可以看出，dM2、dM5-2、M4、dM4和M7组中和抗体水平与Wt组相比有降低趋势，其中只有在Wt假病毒中和试验中，M4、dM4组的降低有统计学意义。单周期感染实验结果显示，除G2改造外，其它改造都使功能性假病毒形成能力大为下降。从动物实验结果可以得出：不同改造对Env免疫原性的影响不同，M2组改造使Env诱导细胞与体液免疫的能力都有一定的提高；dWt组改造，使诱导体液免疫的能力有一定幅度提高，同时诱导细胞免疫的能力没有明显变化；N2010、M5-1、M5-2和dM7虽然诱导细胞免疫能力有所下降，但诱导体液免疫能力有一定程度提高；dM2和G2诱导体液免疫能力降低，但诱导细胞免疫能力有小幅度提高或基本不变；dM5-2、M4、dM4和M7组改造使其诱导细胞及体液免疫的能力都降低。从单周期感染实验结果可以得出：G2（N620Q，N632Q）改造不影响功能性假病毒的形成，而F174A和N2010两个单点的改造使Env丧失了形成功能性假病毒的能力。
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