两种双壳贝类和光棘球海胆微卫星标记的分离及特性研究

论文摘要

本研究利用磁珠杂交筛选和数据库检索两种方法开发了西施舌（Coelomactra antiquata）、魁蚶（Scapharca broughtonii）和光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）三种重要无脊椎动物的微卫星DNA标记。西施舌和魁蚶是我国重要的经济贝类,但是由于近年来过度开采、环境退化,其产量迅速减少。为了研究其遗传多样性和种群结构,制定合理有效的保护措施,本文利用磁珠杂交筛选法首次开发了西施舌和魁蚶的多态性微卫星标记。首先,采用常规苯酚氯仿法从闭壳肌中提取基因组DNA,经限制性内切酶Sau3AI酶切后,选取300-1000 bp大小的片段,用人工设计合成的生物素标记的寡核苷酸重复序列（CA）15作为探针与经过酶切后的基因组DNA进行杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,获得含有微卫星序列的DNA片段。再经过克隆和测序,根据SSR两端的保守区进一步用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,开发多态性微卫星DNA标记,并利用40野生个体检测其多态性。在西施舌分离的9个微卫星位点,其等位基因数为2-28,期望杂合度为0.083-0.921;在魁蚶分离的12个微卫星位点,其等位基因数为2-22,期望杂合度在0.444-0.944。近年来国际公共数据库中表达序列标签（ESTs）呈指数增长,为遗传分析提供了丰富资源。本文利用生物信息学的方法,从美洲紫海胆（S.purpuratus）EST库中首次筛选出9对光棘球海胆EST-SSR。首先,用SSRHunter软件查找美洲紫海胆EST库中含有微卫星片段的DNA序列,选取其中的40条序列用Primer Premier 5.0在重复序列两端合适的位置上设计微卫星引物。合成的引物在光棘球海胆扩增,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,筛选特异性强、等位基因丰富的位点。本论文筛选出的9个光棘球海胆EST-SSR位点的等位基因数为2-13,观察杂合度和期望杂合度分别在0.000-0.645和0.063-0.912。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 DNA 分子遗传学标记概论
• 1.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 1.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 1.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.4 简单序列重复间区的DNA 序列（ISSR）
• 1.5 单链构象多态性（SSCP）
• 1.6 单核苷酸多态性（SNP）
• 1.7 表达序列标签（EST）
• 第二节 微卫星分子标记概述
• 2.1 SSR 标记的原理
• 2.2 SSR 标记的特点
• 2.3 SSR 标记的应用
• 2.4 国内外水产动物SSR 标记的开发现状
• 2.5 SSR 标记的不足之处和发展前景
• 第三节 微卫星分子标记的开发方法
• 3.1 经典法
• 3.2 富集法
• 3.2.1 杂交选择法
• 3.2.2 引物延伸法
• 3.2.3 FIASCO 法
• 3.3 省略筛库法
• 3.4 ISSR 片段扩增法
• 3.5 数据库检索法
• 第四节 本研究的总体设计和研究策略
• 第二章 西施舌和魁蚶微卫星磁珠杂交筛选法的构建
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 样品处理
• 1.2.2 DNA 提取
• 1.2.3 磁珠杂交筛选
• 1.2.3.1 DNA 酶切
• 1.2.3.2 接头连接
• 1.2.3.3 DNA 片段的胶回收
• 1.2.3.4 磁珠杂交富集
• 1.2.3.5 衔接头PCR 反应
• 1.2.3.6 PCR 产物纯化
• 1.2.4 TA 克隆及PCR 筛选
• 1.2.4.1 制备大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.4.2 连接转化反应
• 1.2.4.3 PCR 筛选
• 1.2.5 测序
• 第二节 实验结果
• 2.1 样品DNA 酶切和接头连接结果
• 2.2 磁珠杂交结果
• 2.3 蓝白斑筛选
• 2.4 PCR 筛选结果
• 2.5 测序结果
• 第三节 讨论
• 3.1 限制性内切酶的选择
• 3.2 杂交探针的选择
• 3.3 杂交条件对筛选结果的影响
• 3.4 磁珠杂交筛选法的富集效率
• 第三章 光棘球海胆 EST-SSR 的分离
• 前言
• 第一节 EST-SSR 筛选方法
• 第二节 EST-SSR 筛选结果
• 第三节 讨论
• 第四章 西施舌、魁蚶与光棘球海胆的微卫星多态性检测
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 样品处理
• 1.2.1.1 西施舌和魁蚶样品处理
• 1.2.1.2 光棘球海胆样品处理
• 1.2.2 DNA 提取
• 1.2.2.1 西施舌和魁蚶DNA 提取
• 1.2.2.2 光棘球海胆DNA 提取
• 1.2.3 设计引物
• 1.2.4 引物筛选
• 1.2.5 多态性检测
• 1.2.5.1 群体样品PCR 扩增
• 1.2.5.2 变性聚丙烯酰胺凝胶板的制备
• 1.2.5.3 电泳
• 1.2.5.4 银染显色
• 1.2.6 结果记录及数据分析
• 第二节 实验结果
• 2.1 引物琼脂糖凝胶检测
• 2.2 引物多态性检测
• 2.3 多态性微卫星引物的筛选结果
• 2.3.1 西施舌多态性微卫星引物的筛选结果
• 2.3.2 魁蚶多态性微卫星引物的筛选结果
• 2.3.3 光棘球海胆多态性微卫星引物的筛选结果
• 第三节 讨论
• 3.1 引物设计参数
• 3.2 微卫星多态性检测选择非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3 EST-SSR 的内含子
• 3.4 来自基因组与来自ESTs 的微卫星标记比较
• 3.5 无效等位基因
• 3.6 “结巴”带
• 参考文献
• 致谢
• 硕士就读期间已发表的文章