重组人干扰素纳米磁性脂质体的构建及靶向治疗人原发性肝癌的研究

论文摘要

肿瘤靶向治疗是利用特定的载体将药物在特定的导向机制作用下选择性地定位于肿瘤组织,提高肿瘤组织内的药物浓度,达到提高疗效、降低毒副反应、增加病人顺从性的目的。在本系列实验中,采用逆相蒸发法研制了纳米级磁性干扰素脂质体,考察了磁性干扰素纳米脂质体的体外稳定性、体内外磁场响应性和在原发性肝癌移植瘤裸鼠体内的生物分布,我们也进行了MIL静注后动物的溶血性和急毒性实验,以及用双抗夹心ELISA法检测各实验组和对照组在外加磁场和不加磁场两种状态下,药物干预后动物的血药浓度和组织浓度方面的药动学研究。分别用MTT法、细胞计数法、吖啶橙染色法和DNA ladder法进行细胞生长抑制和凋亡检测。还进行了MIL靶向治疗原发性肝癌移植瘤裸鼠后的分子生物学方面的机理探讨。主要研究结果如下:1、磁性干扰素纳米脂质体粒径平均170nm,干扰素包封率62.71%,磁性颗粒均匀分布于脂质体中。不同的类脂比例、药脂比、有机溶剂种类和油水相体积比影响磁性干扰素纳米脂质体粒径和干扰素包封率。制备后4℃和-20℃保存,8h内渗漏率较低。结果提示磁性纳米脂质体有可能作为干扰素的新型载体应用于恶性肿瘤的靶向治疗中。2、磁性干扰素纳米脂质体体外、体内具有良好的磁场响应性。应用磁性纳米脂质体加磁场的方式给药,干扰素可以有效地聚集到靶部位,显著提高靶部位干扰素的浓度,降低其它组织和器官中的药物浓度。作为干扰素的有效载体,磁性纳米脂质体加磁场的给药方式有望成为肿瘤靶向治疗的新途径。3、通过溶血实验和急毒性实验检测发现MIL在动物体内用药是安全的;采用双抗体夹心ELISA法检测IFN组、MIL组（加磁场）和MIL组（不加磁场）在小鼠体内i.v.后血清和组织中的药物浓度,结果发现:在MIL组（加磁场）,药物在肝和肾内浓度明显升高（p＜0.01）,且滞留时间延长,肝和肾外各组织药物浓度低。说明:MIL在外加磁场作用下,药物在靶区的靶向选择性最好,滞留时间延长;与普通IFN相比,在外加磁场的作用下,MIL改变了IFN在小鼠体内的分布特性,延长了IFN的半衰期,提高了IFN的生物利用度,具有很强的靶向性和缓释性。4、分别用游离IFN、ML、IL和MIL对体外培养的Bel-7402肿瘤细胞进行药物干预,然后再分别用MTT法、细胞计数法、吖啶橙染色法和DNA ladder法进行细胞生长抑制和凋亡检测。实验发现:各组Bel-7402肿瘤细胞的生长受到抑制,并且出现细胞凋亡现象。各实验组和对照组比较显示:MIL组和IL组明显高于游离IFN组,而游离IFN组明显高于ML组和对照组（仅含培养基）。以上结果均具有统计学意义p＜0.05)。以上结果说明MIL能够显著抑制Bel-7402细胞的生长,其作用机制是导致细胞凋亡的发生。5、在原发性肝癌移植瘤裸鼠肿瘤组织外固定永久磁铁后,静脉注射磁性干扰素纳米脂质体可以显著抑制肿瘤组织的生长,抑瘤率为62.50%,高于IFN（27.61%）和IL（28.17%）;RT-PCR显示,MIL的VEGFmRNA表达明显低于对照组和其它实验组（p＜0.01）,而MIL的Caspase-3mRNA表达明显高于对照组和其它实验组（p＜0.01）;Western-blot显示,MIL的VEGF蛋白表达明显低于对照组和其它实验组（p＜0.01）,而MIL的Caspase-3蛋白表达明显高于对照组和其它实验组（p＜0.01）。本研究提示作为化疗药物的新型载体磁性纳米脂质体在肿瘤部位磁场的作用下可以有效提高肿瘤组织内化疗药物浓度减低化疗药物毒副反应显著抑制肿瘤组织的生长。本研究为磁性纳米脂质体作为化疗药物载体进一步应用于临床肿瘤治疗奠定了基础靶向治疗有可能成为肿瘤治疗的新方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.干扰素与原发性肝癌的研究
• 1.1 原发性肝癌的流行病学研究
• 1.2 原发性肝癌的治疗方法
• 1.3 干扰素与原发性肝癌的研究
• 2.纳米磁载体药物与肿瘤靶向治疗的研究
• 2.1 干扰素治疗原发性肝癌的局限性
• 2.2 磁靶向治疗的概念及研究
• 2.3 纳米磁性载药脂质体微球靶向治疗肿瘤的研究
• 3.立题依据
• 4.研究目标与研究内容
• 4.1 研究目标
• 4.2 主要研究内容
• 第二章 重组人干扰素纳米磁性脂质体的制备和理化性质的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 药品和试剂
• 2.1.2 仪器和设备
• 2.2 方法
• 3O₄的制备'>2.2.1 纳米磁性材料—Fe₃O₄的制备
• 2.2.2 重组人干扰素纳米磁性脂质体的制备
• 2.2.3 重组人干扰素纳米磁性脂质体大小测定和形态观察
• 2.2.4 重组人干扰素纳米磁性脂质体中干扰素包封率的测定
• 2.2.5 重组人干扰素纳米磁性脂质体制备工艺的优化
• 2.2.6 重组人干扰素纳米磁性脂质体的体外磁响应性
• 2.2.7 重组人干扰素纳米磁性脂质体保存期间的稳定性
• 2.2.8 重组人干扰素纳米磁性脂质体的灭菌和无菌检测
• 3 结果与分析
• 3O₄的制备'>3.1 纳米磁性材料—Fe₃O₄的制备
• 3.2 重组人干扰素纳米磁性脂质体的制备
• 3.3 重组人干扰素纳米磁性脂质体大小测定和形态观察
• 3.4 重组人干扰素纳米磁性脂质体中干扰素包封率的测定
• 3.4.1 ELISA试剂盒测定干扰素浓度
• 3.4.2 柱分离法
• 3.5 重组人干扰素纳米磁性脂质体制备工艺的优化
• 3.6 重组人干扰素纳米磁性脂质体的体外磁响应性
• 3.7 重组人干扰素纳米磁性脂质体保存期间的稳定性
• 3.7.1 放置时间影响
• 3.7.2 泄漏率
• 3.8 重组人干扰素纳米磁性脂质体的灭菌和无菌检测
• 4 讨论
• 3O₄的制备'>4.1 纳米磁性材料—Fe₃O₄的制备
• 4.2 重组人干扰素纳米磁性脂质体的制备
• 4.3 重组人干扰素纳米磁性脂质体中干扰素包封率的测定
• 4.4 重组人干扰素纳米磁性脂质体制备工艺的优化
• 4.4.1 包封率二次多项式逐步回归
• 4.4.2 平均粒径二次多项式逐步回归
• 4.5 重组人干扰素纳米磁性脂质体的体外磁响应性
• 4.6 重组人干扰素纳米磁性脂质体保存期间的稳定性
• 4.7 重组人干扰素纳米磁性脂质体的灭菌和无菌检测
• 第三章 重组人干扰素纳米磁性脂质体药动学和体内分布的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 动物
• 2.1.2 试剂和药品
• 2.1.3 仪器和设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 干扰素磁性脂质体的安全性试验
• 2.2.2 干扰素磁性脂质体的药动学和体内分布研究
• 3 结果与分析
• 3.1 干扰素磁性脂质体的安全性试验
• 3.1.1 溶血试验
• 3.1.2 急毒性试验
• 3.2 干扰素磁性脂质体的药动学和体内分布研究
• 3.2.1 干扰素ELISA测定法的标准曲线及回归方程
• 3.2.2 回收率实验
• 3.2.3 干扰素磁性脂质体的药动学（血药浓度与时间的关系）研究
• 3.2.4 磁场诱导下干扰素磁性脂质体在组织中的分布
• 3.2.5 药动学解析
• 4.讨论
• 4.1 安全性试验
• 4.1.1 溶血试验
• 4.1.2 急性毒性试验
• 4.2 干扰素磁性脂质体的药动学和体内分布研究
• 4.2.1 干扰素磁性脂质体的药动学研究
• 4.2.2 干扰素磁性脂质体的体内分布研究
• 4.2.3 干扰素磁性脂质体药动学参数解析
• 第四章 重组人干扰素纳米磁性脂质体抑制肝癌细胞生长及诱导其凋亡的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 常用试剂和药品
• 2.1.3 细胞培养用液的配制与消毒
• 2.1.4 常用设备和仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 Bel-7402细胞的培养及单细胞悬液的制备
• 2.2.2 肝癌细胞生长抑制的研究
• 2.2.3 肝癌细胞凋亡的相关研究
• 3 结果与分析
• 3.1 Bel-7402细胞的培养及单细胞悬液的制备
• 3.2 肝癌细胞生长抑制的研究
• 3.2.1 MTT法检测药物干预后肝癌细胞生长的抑制率
• 3.2.2 细胞计数法观察药物干预后肝癌细胞的生长曲线
• 3.3 肝癌细胞凋亡的相关研究
• 3.3.1 吖啶橙荧光单染法观察肝癌细胞的凋亡
• 3.3.2 DNA ladder法检测凋亡肝癌细胞的生理功能
• 4.讨论
• 4.1 Bel-7402细胞的培养及单细胞悬液的制备
• 4.2 肝癌细胞生长抑制的研究
• 4.2.1 MTT法检测药物干预后肝癌细胞生长的抑制率
• 4.2.2 细胞计数法观察药物干预后肝癌细胞的生长曲线
• 4.3 肝癌细胞凋亡的相关研究
• 4.3.1 吖啶橙荧光染色法观察肝癌细胞的凋亡
• 4.3.2 DNA ladder法检测凋亡肝癌细胞的生理功能
• 第五章 重组人干扰素纳米磁性脂质体靶向治疗人原发性肝癌的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.4 其它试剂
• 2.1.5 试剂配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 引物设计及合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 纳米磁性重组人干扰素脂质体的制备
• 2.2.2 人肝癌细胞癌荷瘤裸鼠移植瘤模型的建立
• 2.2.3 外磁场诱导下磁性微球对裸鼠肝癌模型的体内靶向治疗研究
• 2.2.4 RT-PCR检测肿瘤组织内VEGF和Caspase-3 mRNA的表达
• 2.2.5 Western bolt检测肿瘤组织中VEGF和Caspase-3蛋白的表达
• 3 结果与分析
• 3.1 荷瘤裸鼠用药过程中肿瘤体积的变化
• 3.2 荷瘤裸鼠肿瘤瘤重及瘤重抑制率
• 3.3 肿瘤组织内VEGF和Caspase-3 mRNA的检测
• 3.3.1 荷瘤裸鼠肿瘤组织总RNA制备
• 3.3.2 RT-PCR结果
• 3.3.3 PCR产物克隆
• 3.3.4 克隆片段的核苷酸序列分析
• 3.3.5 肿瘤组织内VEGF mRNA的检测
• 3.3.6 肿瘤组织内Caspase-3 mRNA的检测
• 3.4 Western blot检测肿瘤组织中VEGF和Caspase-3蛋白的表达
• 3.4.1 Western blot检测肿瘤组织中VEGF蛋白的表达
• 3.4.2 Western blot检测肿瘤组织中Caspase-3蛋白的表达
• 4.讨论
• 4.1 人原发性肝癌VEGF和CASPASE-3 cDNA的克隆
• 4.2 人原发性肝癌与VEGF和CASPASE-3基因
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的论文、主持及参与的科研课题等