高糖诱导人内皮细胞PKC-δ信号通路中核蛋白效应子的组学研究

论文摘要

背景与目的:在糖尿病血管并发症的发生发展过程中,内皮细胞稳态失调被认为是重要的始动事件。既往研究表明,高糖可延缓细胞增殖,干扰细胞周期,诱发DNA损伤并可轻度加速细胞死亡,其详细的分子机制尚未完全阐明。近年来,大量研究提示,蛋白激酶C（PKC）的激活可能是糖尿病血管病变重要的发病机制之一,但目前尚缺乏针对PKC亚型信号机制特征的全景式描述。糖尿病动物和体外研究均发现,在众多PKC亚型中,β和δ亚型在血管床被优先激活。动物研究和临床试验也表明,PKC-β的活化尚不能完全解释糖尿病视网膜病变的病理特征,然而,目前对PKC-δ的认识无明确结论。研究发现,慢性高糖刺激细胞（如内皮细胞、肾脏系膜细胞、平滑肌细胞）增加二脂酰甘油合成从而诱导PKC-δ活化,并且新近研究进一步发现,在视网膜周细胞中,高糖可通过PKC-δ诱导氧化应激介导的NF-κB激活和血小板源性生长因子（PDGF）β受体信号失活这两个关键途径促进细胞凋亡;在胎羊肺动脉内皮细胞中可通过胞外信号调节激酶（ERK）或Akt途径调节一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶表达;在脂肪酸刺激的β细胞中则通过抑制叉头蛋白O1（FOXO1）活性参与凋亡调节。以上不同环境下的PKC-δ作用表明,PKC-δ影响了细胞凋亡启动及终末环节的不同信号途径。然而,以上的研究仅仅关注某一已知信号通路,实际上,细胞信号级联反应并不是点对点的线性关系,而是相互交联的复杂模式。与以往的研究不同,我们发现高糖负荷人脐静脉内皮细胞（HUVEC）6天可诱导PKC-δ核转位,已知细胞核不仅含有基因信息,并且是基因表达的场所,因此,核蛋白的鉴别对于基因组的功能调节研究至关重要,并可为新蛋白的分子功能研究提供相关线索。另外,鉴于我们通过腺病毒载体转染使PKC-δ持续激活,检测到显著的HUVEC凋亡及周期阻滞,由此假设,PKC-δ作为上游调控元件,寡聚一系列下游效应分子,从而启动了调控细胞行为的信号转导事件,因此,对此信号通路中重要分子的识别将进一步深化对细胞凋亡及周期分子机制的认识。功能蛋白质组学是一项细胞功能分子机制研究的新兴技术,是生理病理条件下蛋白量变的高通量研究的理想工具,在揭示未知蛋白和参与细胞结构功能变化的鲜见蛋白研究上提供了新的方法。如今,蛋白质组学技术已广泛运用于临床与基础研究,但糖尿病并发症的发病机制中却报道甚少,因此,采用蛋白质组学研究高糖条件下PKC-δ促细胞凋亡信号通路的下游效应子具有重要意义。方法:1.重组腺病毒的转染及细胞分组构建表达PKC-δ的重组腺病毒载体Ad5-PKCδ并包装,Ad5-Null作为空载体对照转染HUVEC。共分5组处理细胞:正常葡萄糖对照组（NC,含5.6mmol/L D-葡萄糖）,高糖组（HG,含25mmol/L D-葡萄糖）,空载体对照组（EC,Ad5-Null转染细胞后培养于25mmol/L的高糖培养基中）, PKC-δ过表达组（PO,Ad5-PKCδ转染细胞后培养于25mmol/L的高糖培养基中）,PKC-δ抑制组（PI,Ad5-PKCδ转染细胞后培养于含10umol/L Rottlerin的高糖培养基中）。2.激光共聚焦检测免疫荧光标记PKC-δ生长于爬片上的细胞先后用PKC-δ多克隆抗体及异氰酸荧光素标记二抗孵育。激光共聚焦检测PKC-δ荧光表达强度及分布。3.细胞周期及凋亡检测细胞培养6天后,用流式细胞仪检测细胞周期分布,并将各组细胞用Annexin-FITC标记后采用流式细胞技术检测细胞凋亡率。4.双向电泳及质谱分析从以下四组细胞中提取核蛋白:正糖对照组,高糖组,PKC-δ过表达组及空载体对照组。首先等电聚焦,程序为250V 2h, 500V 1h, 1000V 1h快速, 10000V 6 h,最后聚焦至70000Vh。第二向SDS-PAGE将各组核蛋白按分子量区分开,PDQuest软件分析后找出差异点。胰酶消化各差异蛋白点得到相应肽段,并送质谱分析其肽指纹图谱。5.生物信息学分析将指肽指纹数据输入生物信息数据库中（Mascot）,根据蛋白分子量、等电点及序列覆盖百分比等搜索相关蛋白质信息。结果:1.高糖条件下胞浆中平均荧光强度较正糖条件下增加了1.6倍,胞浆/胞核荧光比减少,PKC-δ过表达后,细胞荧光强度进一步提高了1.8倍,且胞浆/胞核荧光比明显减少（1.49±0.17 vs 2.31±0.33 , p<0.05）。2.正糖条件下,约（4.1±0.67）%的细胞发生早期凋亡,而高糖条件下凋亡率为（22±2.7）%,两者有显著差异。高糖也促使细胞明显阻滞于G0/G1期,约为正糖组的1.3倍。PKC-δ过表达则导致高糖条件下的进一步的周期阻滞和凋亡（p<0.05）,而rottlerin（10umol/L）特异性抑制其表达后,凋亡率减少了约80%且细胞阻滞恢复至正常对照水平。3.通过双向电泳每组得到近600个蛋白点,通过组内及组间比照,发现51个蛋白表达量发生了明显变化,并定义为高糖诱导下的PKC-δ相关蛋白。质谱分析后,51个蛋白点均得到满意的肽指纹图谱。4.通过生物信息学数据库查询,51组PMF筛选出对应的37个蛋白点并分类,它们分别涉及到细胞周期及凋亡调节、肿瘤抑制、转录、应激和核内信号转导等。其中,SGK1、CCND3、CDKN2A、hLin-9、RAPL、GRP78均参与多种细胞凋亡及周期调控通路。结论:本研究表明,PKC-δ系高糖诱导的HUVEC周期阻滞及凋亡的重要调节子,其下游存在多个效应分子,如SGK1, CDKN2A和GRP78等。鉴于内皮细胞凋亡是糖尿病血管并发症的始发事件,其机制尚不明确,因此,本研究进一步深化了对糖尿病血管损伤的认识,提示针对PKC-δ的特异性抑制剂或者PKC-δ信号通路上关键效应子的阻断剂可能成为糖尿病大血管及微血管病变防治的潜在药物治疗靶点。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 Introduction
• 2 Materials and Methods
• 2.1 Materials
• 2.1.1 The main instrument
• 2.1.2 The main reagents and dispensing
• 2.2 Methods
• 2.2.1 Cell culture and recombinant adenovirus transfection
• 2.2.2 Immunofluorescence Labeling of PKC-δand Confocal Microscopy
• 2.2.3 Cell-cycle assay
• 2.2.4 Apoptosis assay
• 2.2.5 Nuclear protein extraction
• 2.2.6 Two-Dimensional electrophoresis
• 2.2.7 Silver staining
• 2.2.8 Preparation of peptide sample and database search
• 2.2.9 Statistical analysis
• 3 Results
• 3.1 Up-regulation and nuclear translocation of PKC-δin HUVEC under high glucose stress
• 3.2 Activation of PKC-δinduces cell cycle arrest and apoptosis in HUVEC under high glucose stress
• 3.3 Two-dimensional electrophoresis of nuclear protein from HUVEC
• 4 Discussion
• 5 Conclusion
• References
• 文献综述
• 致谢
• 硕士期间发表的论文