论文摘要
研究背景：唾液腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma of salivary glands, ACCs）是常见的涎腺上皮来源的恶性肿瘤,其具有局部淋巴结转移率低,而嗜神经性侵袭和远处转移率高两大生物学特性,其局部神经侵袭和10年远处转移分别高达50%和30-40%,单纯手术治疗往往不能根治肿瘤。对于肿瘤大于4cm、临床分期晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）及有神经侵犯者施行术后放疗,可在一定程度上降低肿瘤的局部复发率,但效果不尽如人意。因此如何利用基因治疗的方法,提高唾液腺腺样囊性癌对放射治疗的敏感性,从而提高腺样囊性癌的局部控制率和远处转移率,进一步提高晚期恶性肿瘤的治疗的成功率和患者的生存质量成为现阶段国内外相关研究的热点。由于NF-κB信号通路的持续性激活在肿瘤细胞的抗凋亡机制中发挥重要的作用,与肿瘤细胞的放射抵抗作用密切相关,因此,通过基因工程技术抑制此通路或许可以显著提高肿瘤的放疗敏感性,从而提高腺样囊性癌的放射治疗疗效。研究目的：对腺样囊性癌细胞通过瞬时转染导入IκBα-M的基因,将转染后的ACC-2细胞进行6种剂量（0、2、4、6、8、10Gy）的高能X线照射,在照射后不同时间点（1、3、6、10、24、48h）应用免疫细胞化学检测ACC-2细胞NF-κB p65的核内移位情况,应用Western blot技术定量检测各个时间点NF-κB p65的蛋白表达情况,同时采用流式细胞术和原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）检测相应时间点细胞的凋亡情况,探讨NF-κB信号转导通路在放射线诱导的人唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡中的变化规律。为进一步的动物实验和临床应用提供细胞学实验基础。实验方法：实验采用腺样囊性癌ACC-2细胞系,于37℃恒温下于5%CO2、饱和湿度的孵箱中进行细胞培养,传代细胞。待细胞长至对数生长期后,采用脂质体2000将pBabe-SR-IκBa质粒瞬时转染入ACC-2细胞,Western blot法检测转染后IκBa蛋白表达的变化,将转染后的ACC-2细胞进行6种剂量（0、2、4、6、8、10Gy）的高能X线照射,在照射后不同时间点（1、3、6、10、24、48h）应用免疫细胞化学检测ACC-2细胞NF-κB p65的表达情况,应用Image Pro-Plus图像分析软件测其细胞核平均灰度值,应用Western blot技术定量分析NF-κB p65蛋白表达的变化。并同时应用流式细胞术（Flow cytometric analysis）和原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）检测不同时间点和剂量组的细胞凋亡率。以上各实验步骤统一细胞生长的外环境,并设置转染pBabe空白质粒组和未转染质粒组,关键步骤重复两遍以减少系统误差,并用SPSS16.0软件对数据进行检验分析。实验结果：1.与转染pBabe空白质粒组和未转染质粒组比较,转染pBabe-SR-IκBa质粒ACC-2细胞不仅表达内源性IKBa,同时也表达SR-IκBa;接受相同放射线剂量照射后3h细胞核平均灰度值升高（P<0.05）。2. SR-IκBa质粒组中,免疫组化实验显示不同剂量组的细胞核平均灰度值均低于0Gy组,Western blot技术显示各个剂量组的p65蛋白表达均高于0Gy组。与此相对应的是,流式细胞术（Flow cytometric analysis）和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）显示细胞接受各个剂量放射治疗后的细胞凋亡率均高于未接受放疗的0Gy组。3.免疫组化实验和Western blot技术显示,约在接受照射后6-10h,细胞核平均灰度值达到最低值,此时细胞内NF-κB p65蛋白的表达量达到峰值；相同时间点上,3h组细胞细胞核平均灰度值随放射剂量增加而降低,细胞内NF-κB p65蛋白的表达量也随着放射剂量的增大而增加（P<0.05）。4.流式细胞术（Flow cytometric analysis）和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）显示转染目的基因后,接受放疗的细胞的凋亡率随NF-κB p65蛋白的表达量增加而表现为相反的趋势,即照射后6-10h细胞的凋亡率达到最低值,3h组细胞的凋亡率随照射剂量的增加而降低。研究结论：转染突变的IκBa基因可特异性抑制NF-κB信号通路,经放射线照射诱导凋亡后,NF-κB p65蛋白的表达量具有一定的时间—剂量效应规律,p65蛋白的表达可抑制ACC-2细胞的凋亡。
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