论文题目: 斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与表达调控
论文类型: 博士论文
论文专业: 海洋生物学
作者: 杜长青
导师: 林秀坤
关键词: 斑马鱼,胸胸腺苷酸合成酶,基因克隆,蛋白表达与纯化,干扰
文献来源: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 胸腺苷酸合成酶(Thymidylate synthase,简称TS)催化dUMP生成dTMP和二氢叶酸,dTMP再进一步转化为dTTP,后者是DNA合成的重要前体。多年来TS一直作为癌症化疗的一个重要靶点,斑马鱼作为一种重要的模式生物,已成功用于多种药物筛选模型的构建,但斑马鱼Ts的序列分析、表达调控规律以及在发育过程中的功能尚未见报道。本研究的主要目的是分析TS在斑马鱼体内的表达调控机制,阐明TS在斑马鱼发育过程中的作用,为构建斑马鱼药物筛选模型提供理论基础。 采用RT-PCR和RACE技术,从斑马鱼胚胎中克隆出TS的cDNA全长序列,分析表明它的编码框序列含有957个核苷酸,编码一个分子量为36kD的318个氨基酸的蛋白序列。将斑马鱼TS蛋白完整编码序列连接到pET-28a表达载体上,构建表达载体pET-28/Z-TS,转化进大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导性融合表达,实验表明在1mM的IPTG浓度条件下,诱导表达3h,斑马鱼TS融合蛋白表达量达到比较高的水平。而几种不同浓度的IPTG诱导对融合蛋白的表达量影响较小。利用亲和层析技术分离纯化,获得均一性TS蛋白。酶学性质研究表明纯化的斑马鱼TS蛋白在较低的温度仍呈现酶的催化活性,28℃催化活性达到高峰。测定它与dUMP和二甲基四氢叶酸的相互作用的Km值,结果表明它与人的TS蛋白的Km值接近。 Western杂交分析表明纯化的斑马鱼TS蛋白能够被人的TS单克隆TS-106抗体识别,亲和性与人的TS纯化蛋白表现一致。通过Western杂交分析方法检测斑马鱼TS蛋白在斑马鱼不同胚胎发育时期的表达规律,结果表明TS蛋白在胚胎各个时期都有表达,在1-,4-细胞期表达量较高,说明TS对维持斑马鱼胚胎的发育过程具有重要意义。 为了阐明TS在斑马鱼胚胎发育过程中的重要作用,我们构建了亦斑马鱼TSmRNA为靶点的小分子发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,pSilencer4.1-CMV/TS,采用显微注射技术研究shRNA对TS基因沉默后斑马鱼发育的影响。结果表明在斑马鱼胚胎处于1-细胞期至2-细胞期注射pSilencer 4.1-CMV/TS质粒,在25hpf可引起斑马鱼胚胎发育表型改变,表现为头部和尾部都发育迟缓。为了阐明斑马鱼发育中是否存在胸腺嘧啶代谢的旁路途径,在斑马鱼胚胎培养液
论文目录:
引言
1 胸腺苷酸合成酶的研究进展
2 斑马鱼—一理想的模式生物
3 斑马鱼与人类疾病模型的研究
4 RNA干扰及其应用的研究进展
5 实验技术路线
第一章 斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆与原核表达
第一节 斑马鱼胸腺苷酸合成酶基因的克隆
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
2.实验结果
2.1 总RNA的检测结果
2.2 斑马鱼TS部分cDNA序列的获得
2.3 3’-RACE结果
2.4 5’-RAC结果
2.5 斑马鱼TS序列分析
第二节 斑马鱼胸腺苷酸合成酶的原核表达
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
2.实验结果
2.1 TS表达载体的构建
2.2 斑马鱼TS蛋白在大肠杆菌的诱导表达
2.3 斑马鱼TS蛋白的纯化
2.4 斑马鱼TS的活性和动力学研究
3 讨论
小结
第二章 TS在斑马鱼不同胚胎发育时期的表达
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
2.实验结果
2.1 Western检测人的TS抗体和斑马鱼TS蛋白的亲和性
2.2 Western检测斑马鱼不同胚胎时期的TS蛋白的表达
3.讨论
小结
第三章 Ts基因沉默对斑马鱼胚胎发育的影响
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.2 实验方法
2.实验结果
2.1 shRNA表达载体的酶切鉴定
2.2 RNAi对斑马鱼胚胎发育的影响
2.3 RNAi对TS蛋白表达的影响
3.讨论
小结
结论
参考文献
发表文章
附录
致谢
发布时间: 2006-04-28
参考文献
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